肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導喹諾酮類耐藥基因的研究*

孫元振 張志軍 亓 然

1.濟南市第二婦幼保健院檢驗科，山東 濟南 271100； 2.泰安市中心醫(yī)院檢驗科，山東 泰安 271000

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內(nèi)感染的常見病原菌之一，2017年全國細菌耐藥報告顯示肺炎克雷伯菌的分離率占全部革蘭陰性桿菌的20.2%，分離數(shù)量位居所有分離菌的第二位。同時，肺炎克雷伯菌對三代頭孢菌素的全國平均耐藥率為33.0%。近年來[1]，隨著喹諾酮類抗菌藥物的廣泛應用治療，臨床分離肺炎克雷伯菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性逐年升高。有研究發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導的基因qnr在喹諾酮類耐藥方面發(fā)揮了重要作用[2-4]。為尋找其耐藥原因，本研究對濟南市第二婦幼保健院2018年1月至2018年6月臨床分離的26株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導喹諾酮耐藥基因的流行情況進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2018年1月至2018年6月濟南市第二婦幼保健院臨床分離出的26株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌，標本分別來自痰液、膿液、血液、咽拭子等。

1.2 方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗

采用Walk Away 96 PLUS NC61復合板鑒定菌種及進行藥敏試驗，用紙片擴散法復核qnr陽性菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南和美羅培南抗菌藥物的敏感性。并根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)2017年版要求進行抗菌藥物敏感性判讀[5]。

1.2.2耐藥基因檢測

采用PCR法：用煮沸法提取制備DNA模板，引物和反應程序參照文獻[6]。擴增產(chǎn)物在含2%溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進行DNA電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

DNA測序：隨機取部分陽性基因進行測序，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序，結(jié)果進行BLAST序列比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌藥物敏感實驗結(jié)果

21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌，對頭孢唑林、頭孢噻肟和頭孢吡肟的耐藥率均為100.0%(21/21)，對頭孢西丁和頭孢他啶的耐藥率分別為14.3%(3/21)和47.6%(10/21)，對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為4.8%(1/21)和52.4%(11/21)，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為52.4%(11/21)和38.1%(8/21),對亞胺培南和美羅培南全部敏感。21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌對11種抗生素的敏感情況見表1。

表1 21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌對11種抗生素的敏感情況

2.2 喹諾酮類耐藥基因qnr及測序結(jié)果

26株肺炎克雷伯菌中，共21株(80.8%)檢測出qnr基因，其中1株(3.9%)qnrA基因陽性(圖1A)，7株(26.9%)qnrB基因陽性(圖1B)，15株(57.7%)qnrS基因陽性(圖1C)；3株(11.5%)qnrB和qnrS同時陽性。 取qnrA陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果為qnrA。隨機取3株qnrB陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果為qnrB。隨機取3株qnrS陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果為qnrS。

3 討 論

近年來，本院細菌耐藥結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌的分離率一直位居前列。肺炎克雷伯菌已成為本院院內(nèi)感染的常見病原菌之一。隨著肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類抗菌藥物的多重耐藥，喹諾酮類抗菌藥物成為臨床常用的抗生素之一，因此我院近年來臨床的分離的肺炎克雷伯菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率逐年上升。

圖1 qnr耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖

通常認為肺炎克雷伯菌對喹諾酮類耐藥機制主要是天然耐藥，即病原菌對抗生素的耐藥機制主要為染色體介導，不會發(fā)生耐藥基因的轉(zhuǎn)移。近年來，研究發(fā)現(xiàn)除了天然耐藥之外，還有獲得性耐藥，即同種或不同種細菌之間可以發(fā)生基因的水平傳播，通過耐藥基因載體如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等介導，引起細菌耐藥性的廣泛、迅速傳播，導致多藥耐藥。耐藥基因載體的參與是臨床多藥耐藥形成的重要原因，其中qnr基因就是臨床耐藥基因載體質(zhì)粒攜帶的常見耐藥基因。美國學者發(fā)現(xiàn)qnr在產(chǎn)ESBLs菌株中檢出率高，qnr與ESBLs有著很強的關(guān)聯(lián)性[2，7-9]。因此本研究選取我院2018年1月至2018年6月臨床分離的26株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對其qnr基因進行報道研究。

研究發(fā)現(xiàn)，我院26株肺炎克雷伯菌中qnr的陽性率高達80.8%(21/26)，其中qnrS基因型的表達率最高，占57.7%(15/26)，其次為qnrB基因型，陽性率為26.9%(7/26)，只有一株菌株表達qnrA基因型，陽性率占3.9%(1/26)。與其它地區(qū)相比我院臨床分離的產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌qnr基因攜帶率較高，2011年姜梅杰等[6]報道的泰安地區(qū)耐頭孢噻肟的肺炎克雷伯菌中qnr陽性率為43.9%。而Robicsek A等研究發(fā)現(xiàn)，耐頭孢他啶的肺炎克雷伯菌中qnr的陽性率僅為20%[10]。出現(xiàn)上述耐藥基因的差異可能是由于各地區(qū)抗菌藥物的使用不同導致。因此在以后的臨床工作中，我們需從思想上重視肺炎克雷伯菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性問題，加強喹諾酮類藥物使用的規(guī)范化和合理化,合理使用抗生素，檢測細菌耐藥情況，切斷傳播途徑，防止耐藥菌的交叉感染。