林列坤　盧春生　鄭義　楊菊紅　鄒繼彬　王一娜　譚鴻熙

【摘要】 目的 探討支氣管肺泡灌洗液中人矮小同源盒基因2（SHOX2）、RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）基因甲基化檢測在肺癌診斷中的應(yīng)用效果。方法 202例呼吸科住院患者， 其中33例經(jīng)組織病理診斷肺癌患者， 169例肺部良性結(jié)節(jié)疾病患者， 收集所有患者支氣管肺泡灌洗液， 然后修飾純化脫氧核糖核酸（DNA）， 進(jìn)行SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測， 觀察其肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性、特異性及診斷準(zhǔn)確率， 并比較SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌敏感性， 比較SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌病理學(xué)四期敏感性。結(jié)果 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準(zhǔn)確率為89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準(zhǔn)確率為91.58%。SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性分別為87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于細(xì)胞學(xué)的54.55%（18/33）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 細(xì)胞學(xué)診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于細(xì)胞學(xué)診斷。其中SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅱ期肺癌的敏感性高于細(xì)胞學(xué)診斷， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測有助于肺癌的早期診斷， 可以作為新型的腫瘤分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 人矮小同源盒基因2;RAS相關(guān)區(qū)域家族1A;甲基化;肺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.001

Application of detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer? ?LIN Lie-kun， LU Chun-sheng， ZHENG Yi， et al. University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital， Shenzhen 518106， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the application effect of detection of short stature homobox 2 （SHOX2） and RAS association domain family1A （RASSF1A） gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer. Methods? ?There were 202 hospitalized patients in respiratory department， including 33 cases of lung cancer diagnosed by histopathology and 169 cases of benign pulmonary nodule disease. The bronchoalveolar lavage fluid was collected from all patients， and then modified and purified deoxyribonucleic acid （DNA） was used to detect the methylation of SHOX2 and RASSF1A genes. The sensitivity， specificity and diagnostic accuracy of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid for the diagnosis of lung cancer was observed. The sensitivity of SHOX2， RASSF1A gene methylation detection and cytological diagnosis of lung cancer were compared， and the sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation and cytological diagnosis of lung cancer pathological stage 4 were compared. Results? The sensitivity， specificity and accuracy of SHOX2 gene methylation in alveolar lavage fluid were 87.88%， 89.35% and 89.11% respectively. The diagnostic sensitivity， specificity and accuracy of RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid were 81.82%， 93.49% and 91.58% respectively. The sensitivity of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in the diagnosis of lung cancer was 87.88% （29/33） and 81.82% （27/33）， respectively， which were higher than 54.55% （18/33） of cytology （P<0.05）. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 75.00% （6/8）， 94.12% （16/17）， 83.33% （5/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of cytological diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 37.50% （3/8）， 52.94% （9/17）， 66.67% （4/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅱ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis （P<0.05）. Conclusion? ?Detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid is helpful for early diagnosis of lung cancer and can be used as a new molecular marker of cancer.

【Key words】 Short stature homobox 2; RAS association domain family1A; Methylation; Lung cancer

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一， 病死率在各類腫瘤中居首位， 我國由于社會人口老齡化加劇， 加之吸煙、大氣污染等因素影響， 我國肺癌的發(fā)病問題更加突出[1]。據(jù)我國癌癥中心數(shù)據(jù)報道， 我國每年新發(fā)肺癌病例78萬， 其中死亡病例70萬。同時， 由于肺癌早期癥狀不明顯， 患者就診晚， 往往錯過最佳診斷治療時機(jī)， 致使肺癌的發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢[2]。目前臨床檢測肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)為病理學(xué)檢查， 由于早期肺癌（原位和ⅠA期肺癌）多位于直徑1 cm的結(jié)節(jié)內(nèi)， 大多很難取得活體組織標(biāo)本明確病理診斷。其他診斷方法有X射線、支氣管鏡檢查、螺旋CT和細(xì)胞學(xué)檢查， 但均存在著較高的漏診率及敏感性較差的特點(diǎn)。由于缺乏有效的篩查和診斷手段， 只有14%的早期肺癌能被診斷， 5年生存率僅為16%， 因此， 早期有效準(zhǔn)確的篩查和診斷肺癌， 是臨床面臨的迫切問題。目前， DNA甲基化修飾在腫瘤形成的早期即發(fā)生， 是很多腫瘤的里程碑事件[3]。本文通過對支氣管肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測， 探討SHOX2

和RASSF1A基因甲基化對肺癌診斷的作用， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2018年1月～2019年2月本院202例呼吸科住院患者， 其中33例經(jīng)組織病理診斷肺癌患者， 男24例， 女9例;年齡42～72歲;包括鱗癌19例， 腺磷癌3例，

腺癌7例， 小細(xì)胞癌4例;Ⅰ期8例， Ⅱ期17例， Ⅲ期6例， Ⅳ期2例。169例肺部良性結(jié)節(jié)疾病患者， 男108例， 女61例;年齡35～79歲;包括支氣管擴(kuò)張22例， 慢性阻塞性肺疾病38例， 肺炎89例， 肺部占位腫物20例。

1. 2 試劑與儀器 試劑：上海透景生物科技有限公司提供， 嚴(yán)格按說明書操作。儀器：ABI7500全自動熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀。

1. 3 研究方法

1. 3. 1 支氣管肺泡灌洗液收集 術(shù)前交代患者纖維支氣管鏡檢查目的、注意事項并簽署檢查同意書。先行術(shù)前準(zhǔn)備， 然后所有患者均予以纖維支氣管鏡經(jīng)鼻插入， 先檢查左右支氣管， 并根據(jù)患者胸部CT顯示的病變部位， 將纖維支氣管鏡遠(yuǎn)端楔于病變所在的段支氣管開口處， 彌漫病變則沖洗右中葉或左舌葉， 注入37℃溫生理鹽水， 20 ml/次， 灌洗2次， 以13 kPa負(fù)壓盡可能吸盡灌洗液， 收集約10～20 ml肺泡灌洗液， 2000 r/min離心5 min， 棄上清， 留500 μl左右含脫離細(xì)胞液體， 再加入500 μl細(xì)胞保存液， 混勻， 2000 r/min離心5 min， 棄上清， 余500 μl于2～8℃保存待檢。

1. 3. 2 操作過程 標(biāo)本采集→DNA提取， 亞硫酸鹽修飾→修飾后DNA純化→實(shí)時熒光PCR檢測→分析判斷結(jié)果。肺泡灌洗液提取DNA后要求：OD260/OD280：1.6～2.0;DNA濃度≥10 ng/μl。

1. 4 觀察指標(biāo) 觀察肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷敏感性、特異性及診斷準(zhǔn)確率， 并比較SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌敏感性，? 比較SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌病理學(xué)四期敏感性。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化檢測情況 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準(zhǔn)確率為89.11%。見表1。

2. 2 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化檢測情況 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準(zhǔn)確率為91.58%。見表2。

2. 3 SHOX2、RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌敏感性比較 SHOX2、RASSF1A基因甲基化診斷肺癌敏感性分別為87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于細(xì)胞學(xué)的54.55%

（18/33）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 SHOX2、RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌敏感性比較結(jié)果柱狀圖

2. 4 SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌病理學(xué)四期敏感性比較 SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基

化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 細(xì)胞學(xué)診斷Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于細(xì)胞學(xué)診斷。其中SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅱ期肺癌的敏感性高于細(xì)胞學(xué)診斷， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化與細(xì)胞學(xué)診斷肺癌病理學(xué)四期敏感性比較結(jié)果柱狀圖

3 討論

SHOX2稱為人矮小同源盒基因2， 是同源盒基因的一員， 其基因序列還有兩個CpG島[4]。研究發(fā)現(xiàn)， SHOX2基因在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常， 如肺癌、乳腺癌和腎癌[5， 6]。有研究顯示， 對肺癌患者的癌細(xì)胞進(jìn)行全基因組分析， 并通過重甲基特異性甲基化實(shí)驗分析， 發(fā)現(xiàn)大部分肺癌患者的肺癌組織SHOX2發(fā)生高度甲基化[6]， SHOX2基因的甲基化有可能成為肺癌的早期篩查指標(biāo)。RASSF1是從最小純合缺失區(qū)分離出的一種能與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用的基因， 其中一種RASSF1A已被確認(rèn)為是一種候選腫瘤抑制基因， 在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常， 并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[7]， 在肺癌、腎癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)。有研究利用基因組測序法檢測RASSF1基因啟動子CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)， 發(fā)現(xiàn)40%的肺癌組織中標(biāo)本中RASSF1As基因啟動子CpG位點(diǎn)完全甲基化[4]。

目前， 電子纖維支氣管鏡已成為診斷呼吸道腫瘤的主要工具[8， 9]， 因而進(jìn)行電子纖維支氣管鏡取樣后的肺泡灌洗液進(jìn)行基因的甲基化檢測可減少患者的機(jī)體損傷， 也是實(shí)現(xiàn)肺癌早期診斷， 提高肺癌患者生存率的重要途徑。本文檢測肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的情況， 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化診斷敏感性為87.88%， 特異性為89.35%， 診斷準(zhǔn)確率為89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化診斷敏感性為81.82%， 特異性為93.49%， 診斷準(zhǔn)確率為91.58%。可見SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測對臨床肺癌均具有診斷價值， 符合相關(guān)研究結(jié)論 [10， 11]。本研究中， 肺泡灌洗液SHOX2聯(lián)合RASSF1A基因甲基化診斷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分別為75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 因為腫瘤細(xì)胞特異性形態(tài)變化未明顯顯示及病理取樣局限性等原因， 早期檢測肺癌的檢出率受限[12]， 而其客觀性也受病理診斷醫(yī)生的主觀意識影響極大， 導(dǎo)致肺癌早期發(fā)現(xiàn)早期治療的臨床目標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)。據(jù)相關(guān)其他研究提示， 部分甲基化陽性的肺部結(jié)節(jié)患者即使現(xiàn)階段病理和影像學(xué)不支持肺癌的診斷， 隨訪6個月后， 有部分患者會呈現(xiàn)肺癌的臨床指征[13]。

本研究結(jié)果可見， SHOX2基因甲基化能較好的區(qū)分肺部良惡性病變， 顯示甲基化的SHOX2不僅可以作為早期檢測的生物指標(biāo)， 而且SHOX2甲基化可以作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)， 這與目前研究結(jié)論相符合[14]。RASSFlA基因調(diào)控的靶基因涉及基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多方面功能， 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因， 在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用尤為重要。目前認(rèn)為， RASSFlA基因表達(dá)失活主要與啟動子區(qū)異常的高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失有關(guān)， 是一種較早發(fā)現(xiàn)的與肺癌相關(guān)的抑癌基因， 能有效提高腺癌檢出， 所以與SHOX2聯(lián)合， 能較好提高早期肺癌檢出率， 鑒別肺小結(jié)節(jié)的良惡性臨床診斷[15]。結(jié)合病理細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示， 各肺癌病理類型樣本均有較好的檢出效果， 鱗癌和小細(xì)胞肺癌效果更好， 估計是由于小細(xì)胞和鱗癌發(fā)生部位居中， 纖維支氣管鏡易于到達(dá)， 取得脫落細(xì)胞數(shù)量比周邊組織位置高， 甲基化檢測結(jié)果容易被顯示出來。

異常甲基化是很多腫瘤的里程碑事件， 甲基化修飾在腫瘤形成的早期即發(fā)生， 同時DNA甲基化的檢測， 在實(shí)驗室容易實(shí)現(xiàn)開展檢測， 不容易被取樣部位、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、人員技術(shù)水平等因素限制。同時肺泡灌洗液的獲取對患者造成的機(jī)體損傷較少， 在臨床易于開展。

總之， 肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的檢測， 能提高早期肺癌檢出率、彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)的敏感性和客觀性不足的缺憾， 有助于對早期肺癌的診斷， 是肺癌早期診斷重要的分子標(biāo)志物。

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[收稿日期：2019-04-11]