孫曉莉，高建，潘樂欣，胡濤，孟斌，金天明

豬大腸桿菌性腹瀉病的病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

孫曉莉，高建，潘樂欣，胡濤，孟斌，金天明通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

通過(guò)對(duì)天津市某規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉病豬實(shí)質(zhì)臟器及腸道內(nèi)容物的細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)，對(duì)腹瀉病的病原進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明：分離菌株在顯微鏡下呈革蘭氏陰性短桿菌，生化反應(yīng)特性與大腸桿菌一致；PCR擴(kuò)增16S rRNA基因得到1 373 bp的目的條帶，經(jīng)同源性分析，該分離菌株與WTPii241菌株同源性為99.9%，最終確定該分離菌株為大腸桿菌。藥敏試驗(yàn)顯示該菌株對(duì)頭孢哌酮和哌拉西林敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、卡那霉素、氯霉素中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林等8種藥物耐藥，上述試驗(yàn)結(jié)果為豬大腸桿菌性腹瀉病的臨床用藥提供了理論依據(jù)。

豬腹瀉??；大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

大腸桿菌（）又稱大腸埃希氏菌，是食品衛(wèi)生安全評(píng)價(jià)中重要的指標(biāo)菌[1]，普遍存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，常引起嚴(yán)重的敗血癥和腹瀉病[2-3]。仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的仔豬消化道傳染病，發(fā)病率和死亡率均較高[4]。近年來(lái)，仔豬腹瀉病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的疾病之一，常造成仔豬生長(zhǎng)緩慢、增重遲緩、致死率增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。由于養(yǎng)殖過(guò)程中不合理的使用抗菌藥，導(dǎo)致病菌的耐藥性不斷增加，給該病的防治帶來(lái)了極大的困難[6-7]，同時(shí)對(duì)人類健康及公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[8]。

2018年3月，天津市某規(guī)?；i場(chǎng)仔豬發(fā)生嚴(yán)重腹瀉。通過(guò)對(duì)病死豬無(wú)菌采集病料、細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢，分離得到6株具有大腸桿菌典型特征的菌株，通過(guò)對(duì)分離菌株的生化鑒定、PCR檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)及動(dòng)物致病性試驗(yàn)，最終確定該分離菌株為大腸桿菌。

1 材料

1.1 病料

病料采自天津市某規(guī)模化豬場(chǎng)送檢的5頭病死豬實(shí)質(zhì)臟器及腸道內(nèi)容物。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF昆明小鼠18只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重20～22 g/只，雌雄各半。

1.3 主要試劑及菌株

MHA培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、胰蛋白胨和細(xì)菌微量生化鑒定管購(gòu)自青島海博技術(shù)有限公司，瓊脂粉、革蘭氏染液、酵母粉（OXOID）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，2×PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，引物合成、測(cè)序由上海捷瑞生物工程有限公司完成，血瓊脂平板購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 主要儀器

無(wú)菌潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2D型）、PCR擴(kuò)增儀（BIO RAD）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、高壓蒸汽滅菌機(jī)（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（LRH-250-ZII）、電子天平（BIO RAD）、生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離與生長(zhǎng)特性觀察

剖檢腹瀉仔豬，無(wú)菌采集各實(shí)質(zhì)臟器組織器官及腸道內(nèi)容物，劃線接種于LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，次日觀察生長(zhǎng)情況。從培養(yǎng)基上挑取形態(tài)大小不一的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后獲得分離菌的純培養(yǎng)物。

將純培養(yǎng)物接種于SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、三糖鐵斜面培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落的形態(tài)特征，并篩除菌落形態(tài)大小相似培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的菌株。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡鏡檢后觀察、記錄菌體的形態(tài)特征。

2.3 生化試驗(yàn)

選取蔗糖、乳糖、木糖等14種細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)。分別取100 μL細(xì)菌懸濁液加入細(xì)菌微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察顏色變化，并與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)比。

2.4 16S rRNA

選擇通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇）和1 492R（5＇-TACGGCTACCTT GTTACGACTT-3＇）擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA片段。PCR擴(kuò)增體系（25mL）為：菌液 2mL、上下游引物各1mL、2×PCR Master Mix 12.5mL、ddH2O 8.5mL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 55 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，并將PCR產(chǎn)物送至上海捷瑞有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后提交GenBank/Blast查找同源序列，并利用BioEdit軟件進(jìn)行序列分析比對(duì)。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將18只SPF昆明小鼠隨機(jī)分成兩組，每組9只。細(xì)菌濃度培養(yǎng)至OD600＝0.5～0.8，離心后用新鮮LB液體培養(yǎng)基稀釋至1×109CFU/mL，試驗(yàn)組小鼠按100 μL/只腹腔注射。對(duì)照組腹腔注射等體積無(wú)菌生理鹽水，每隔2 h觀察小鼠臨床特征，小鼠死亡后立即對(duì)胸腹腔內(nèi)實(shí)質(zhì)性器官進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查。

2.6 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）M100-ED28和CLSI M02-ED13標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922。從血瓊脂平板上挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?。?00mL菌懸液涂布于MHA平板上，待瓊脂充分吸收菌液后，每個(gè)平板上放置5個(gè)藥敏片，置37 ℃培養(yǎng)16～18 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離菌株的生長(zhǎng)特性觀察

從5頭發(fā)病仔豬體內(nèi)分離得到6株具有大腸桿菌典型特征的菌株。在麥康凱培養(yǎng)基上，分離菌株呈玫瑰紅色、表面光滑濕潤(rùn)略凸起、邊緣整齊的圓形大菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，呈黑色金屬光澤的大菌落；在SS培養(yǎng)基上呈粉紅色、表面光滑略凸起、邊緣整齊的圓形小菌落；在三糖鐵斜面培養(yǎng)基上，斜面和底部均變黃，底部產(chǎn)氣；在血瓊脂培養(yǎng)基上，分離菌株呈黃色、中等大小的菌落，且周圍未發(fā)生溶血（圖1）。從具有大腸桿菌典型特征的6株菌株中，隨機(jī)挑選典型菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 血平板試驗(yàn)

革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果表明，該分離菌株為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌（圖2）。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（1 000×）

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，符合大腸桿菌的生化特征（表1）。

表1 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

注：“＋”表示陽(yáng)性，“－”表示陰性

3.3 16S rRNA及序列比對(duì)

對(duì)具有典型大腸桿菌特征的分離菌株進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增及電泳后，其擴(kuò)增條帶大小為1 373 bp，與大腸桿菌的預(yù)期片段大小一致（圖3）。經(jīng)NCBI/blast分析，結(jié)果與大腸桿菌WTPii241菌株同源性較高。

圖3 16S rRNA片段擴(kuò)增結(jié)果

注：M為DL2501 Marker；1為分離菌株16S rRNA片段擴(kuò)增結(jié)果

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在測(cè)定的14種藥物中，該分離菌株對(duì)頭孢哌酮和哌拉西林敏感；對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、卡那霉素、氯霉素中度敏感；對(duì)氨芐西林、頭孢唑林等8種藥物耐藥（表2）。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論與結(jié)論

菌懸液接種小鼠12 h后，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、食欲不振等臨床癥狀，對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)和飲食均正常。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在麥康凱培養(yǎng)基上，分離于豬和小鼠的菌株均呈玫紅色圓形菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，菌落均呈黑色金屬光澤的中等大小菌落。革蘭氏染色后菌體形態(tài)為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。對(duì)該菌株的16S rRNA基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)NCBI/Blast數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，該菌株與WTPii241菌株同源性為99.9%，綜合上述結(jié)果，最終確定該分離菌株為大腸桿菌。藥敏結(jié)果顯示，該菌株僅對(duì)頭孢哌酮和哌拉西林敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、卡那霉素、氯霉素中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林等8種藥物耐藥，故臨床治療藥物選擇范圍窄。

大腸桿菌廣泛分布于動(dòng)物和人腸道內(nèi)，屬于正常寄居菌，其他各血清型大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物均有致病性，主要以腹瀉為主。尤其是初生仔豬，極易發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[9]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模迅速擴(kuò)大，由致病性大腸桿菌引起的仔豬黃痢和白痢發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，導(dǎo)致仔豬成活率低，極大地阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[10]。

本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果證明，分離得到的大腸桿菌對(duì)多種藥物（例如青霉素類、頭孢類藥物等）具有較強(qiáng)的敏感性，這可能是由于豬場(chǎng)大量使用這些藥物進(jìn)行預(yù)防或在飼料中長(zhǎng)期大量添加抗生素所致。另外，臨床獸醫(yī)工作人員在臨床診斷治療前應(yīng)做藥物敏感性試驗(yàn)，再制定針對(duì)性治療。

綜上所述，本試驗(yàn)對(duì)豬大腸桿菌病進(jìn)行分離鑒定，并為有效防治該病提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

[1] Altalhi A D，Hassan S A. Bacterial quality of raw milk investigated byand isolates analysis for specific viru-lence-gene markers[J]. Food Control，2009，20（10）：913-917.

[2] Duffy G，Lynch O A，Cagney C. Tracking emerging zoonotic pathogens from farm to fork[J]. Meat Sei，2008， 78（1-2）：34-42.

[3] Badura A，Luxner J，F(xiàn)eierl G，et a1. Prevalence，antibiotic resistance patterns and molecular characterization offrom Austrian sandpits[J]. Environmental Pollution，2014，194（7）：24-30.

[4] Zanella A，Alborali G L，Bardotti M，et al. Severe111 septicaemia and polyserositis in hens at the start of lay[J]. Avian Pathology，2000，29（4）：311-317.

[5] Zhang W，Zhao M，Ruesch L，et al. Prevalence of viru-lence genes instrains recently isolated fromyoung pigs with diarrhea in the US[J]. Veterinary Microbiology，2007，123（1-3）：145-152.

[6] Scott W J. Antimicrobial resistancein in companion animals[J]. Animal Health Research Reviews，2008，9（2）： 169-176.

[7] Bennett P M. Plasmid encoded antibiotic resistance：Acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria[J]. British J Pharmacol，2009，153（S1）：347-357.

[8] 李淑紅，王京仁，成鋼，等. 豬大腸桿菌和葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（8）：195-198.

[9] 周宏偉，施萬(wàn)富，孫如林. 鵝大腸桿菌的分離鑒定[J].畜牧與飼料科學(xué)，2008（3）：32.

[10] 吳利軍，周丹娜，邵志勇，等. 仔豬腹瀉大腸桿菌分離鑒定及血清型與耐藥性分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018，57（6）：96-97.

Isolation and identification and drug sensitivity test ofof pigs

SUN Xiao-li, GAO Jian, PAN Le-xin, HU Tao, MENG Bin, JIN Tian-mingCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to provide a medication scheme for swinedisease, this experiment identified the isolation of strains by the separation of the bacteria culture, staining microscopy, biochemical experiment, PCR detection and drug susceptibility test methods and so on for diarrheal disease pigs’ parenchymal visera and intestinal contents in large-scale swine farms of Tianjin. The results showed that the isolates strain were gram-negative under microscope, which was short rod. Its biochemical reaction was the same as that ofand the strain was sensitive to cefoperazone and piperacillin and was moderate sensitive to ceftriaxone, cefuroxime, kanamycin and chloramphenicol, but resistant to eight drugs, such as ampicillin, cefazolin and so on. PCR amplified the 16S rRNA gene to obtain the desired target band（1 373 bp）. Homology analysis results showed that the isolation strain was similar to the WTPii241 strain, with the similarity of 99.9%. The isolate strain was confirmed to bebased on the identification results. These results provide a theoretical basis for the clinical use of diarrhea.

swine diarrhea;; separation and identification; drug sensitive test

S852.61

A

1008-5394（2019）02-0057-04

10.19640/j.cnki.jtau.2019.02.013

2019－03－13

2017年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710061107）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（17ZXGSNC00030）

孫曉莉（1997-），女，本科在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物藥學(xué)。E-mail：361861379@qq.com。

金天明（1968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槊庖卟±韺W(xué)。E-mail：jtm680@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷