夏成林，于月華，左 林，陳全家，倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中功能最多樣化的家族之一，已被證實(shí)在多種植物中參與調(diào)控不同的代謝途徑[1]。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有1～4個(gè)由 50～53個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的不完全重復(fù)的高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，即MYB結(jié)構(gòu)域[2]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域位置和數(shù)目的不同，可將其分為4類(lèi)(R1/2-MYB 或R3-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB)[3]。自從在玉米中克隆首個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因 C1[4]后，在多種生物中也相繼發(fā)現(xiàn)含有R2R3-MYB的同源基因，研究發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多種次生代謝途徑，如苯丙烷類(lèi)代謝途徑、細(xì)胞壁組分合成和硫代葡萄糖苷的生物合成等，進(jìn)而對(duì)植物次生壁的形成發(fā)揮調(diào)控作用[5]。

木質(zhì)素(Lignin)是一種苯環(huán)結(jié)構(gòu)的天然高分子物質(zhì)，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁骨架的重要組成部分[6]。在植物維管組織的機(jī)械強(qiáng)度、抵抗病菌侵害和運(yùn)輸水分等方面發(fā)揮著重要作用[7]。近年來(lái)的研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子與多種順式作用元件結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)。MYB轉(zhuǎn)錄因子與木質(zhì)素代謝相關(guān)基因啟動(dòng)子序列中的一些順式作用元件結(jié)合，如AC-Ⅰ、AC-Ⅱ、AC-Ⅲ等順式作用元件，進(jìn)而對(duì)木質(zhì)素的合成產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用[8]。木質(zhì)素含量降低會(huì)造成作物株系易倒伏，易被病菌侵染等不良狀況的發(fā)生[9]。為了克服這一現(xiàn)象，一些經(jīng)濟(jì)作物的改良需要適當(dāng)增加木質(zhì)素在莖稈中的合成積累，適當(dāng)提高單位面積下細(xì)胞的數(shù)目，降低細(xì)胞排列分布的間隙，使改良的木質(zhì)部導(dǎo)管壁韌性加強(qiáng)，從而可以在極大程度上降低病菌的感染入侵，對(duì)減少水分流失也有一定抑制作用[10]。

陸地棉(Gossypiumhirsutum)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉花的抗倒伏性狀依賴(lài)于莖稈組織中木質(zhì)素的機(jī)械支撐作用。因此，研究調(diào)控棉花莖稈木質(zhì)素代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能具有重要的意義。本研究旨在分析過(guò)表達(dá) GhMYB4基因?qū)﹃懙孛耷o稈中木質(zhì)素合成的影響。為深入研究 GhMYB4基因在陸地棉中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 對(duì)照受體棉花株系為‘cqj-5’，轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá) GhMYB4棉花株系為T(mén)4代植株，編號(hào)為‘lrp1’～‘lrp29’。試驗(yàn)材料栽種于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花光照培養(yǎng)室培育。

1.1.2 試劑 甲醇、巰基乙酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品、間苯三酚、超純水和雙蒸水。

1.2 方 法

1.2.1 棉花莖稈木質(zhì)素化學(xué)組織染色 對(duì)35～55 d棉花莖稈材料進(jìn)行化學(xué)組織染色。分別取對(duì)照受體和轉(zhuǎn)基因型株系距離下胚軸0～1 cm、 2～7 cm、10～12 cm部位徒手制作臨時(shí)切片。參考Wiesner法[11]在切片表面滴加w=15%間苯三酚和φ=10%鹽酸溶液，漂洗后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 棉花莖稈木質(zhì)素總量測(cè)定 樣品取自 45 d棉花莖稈距離下胚軸2～7 cm處的對(duì)照受體株系和轉(zhuǎn)基因株系莖稈，做3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。參考Klason法[12]，獲得木質(zhì)素-巰基乙酸(LTGA)沉淀物。用2 mL的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液溶解棕色沉淀。在紫外分光光度計(jì)下的280 nm處測(cè)定木質(zhì)素溶液的吸光度。

1.2.3 棉花木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 稱(chēng)取100 mg木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液溶中，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。在25 mL容量瓶中將木質(zhì)素的終質(zhì)量濃度再稀釋成不同的6份，用紫外分光光度計(jì)在280 nm處測(cè)定溶液的吸光值。

表1 棉花木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度的測(cè)定Table 1 Determination of cotton lignin standard curve

1.2.4 棉花木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出棉花莖稈中木質(zhì)素的質(zhì)量濃度 ，再利用下面公式計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)=C(μg/mL)×2(mL)× 0.001/0.03(g)

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花莖稈木質(zhì)素的化學(xué)組織染色

用Wiesner法對(duì)棉花莖稈進(jìn)行染色，根據(jù)染色程度的深淺和范圍可以初步反映出木質(zhì)素的積累情況，以及所在的組織位置和分布情況。以下試驗(yàn)株系均是以轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系為例與對(duì)照受體‘cqj-5’株系進(jìn)行的結(jié)果比對(duì)分析。

2.1.1 初生木質(zhì)部木質(zhì)素染色范圍距離分析 在電子顯微鏡10×物鏡下觀察木質(zhì)素組織染色區(qū)域發(fā)現(xiàn)(圖1)，在距離下胚軸0～1 cm、2～ 7 cm、10～12 cm處進(jìn)行對(duì)比，依據(jù)細(xì)胞排列的方向進(jìn)行直線測(cè)量，發(fā)現(xiàn)大部分的‘lrp17’轉(zhuǎn)基因株系相比對(duì)照受體‘cqj-5’株系在初生木質(zhì)部區(qū)域的染色范圍距離更長(zhǎng)。在初生木質(zhì)部染色范圍距離的定量分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，在距離下胚軸0～1 cm和2～7 cm中，轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照受體株系在染色的范圍距離上具有顯著性的增加。

2.1.2 初生木質(zhì)部木質(zhì)素染色細(xì)胞層數(shù)分析 在電子顯微鏡40×物鏡下觀察初生木質(zhì)部染色區(qū)域發(fā)現(xiàn)(圖3)，大部分轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系初生木質(zhì)部的細(xì)胞排列層數(shù)相比對(duì)照受體株系‘cqj-5’有一定增多。通過(guò)對(duì)細(xì)胞層數(shù)的定量分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，在距離下胚軸2～7 cm處，轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系相比對(duì)照受體‘cqj-5’株系具有顯著性的增加。

2.1.3 初生韌皮部木質(zhì)素染色深淺程度分析 在電子顯微鏡40×物鏡下觀察初生韌皮部染色區(qū)域發(fā)現(xiàn)(圖5)，在距離下胚軸0～1 cm、2～ 7 cm、10～12 cm處進(jìn)行對(duì)比，‘lrp17’轉(zhuǎn)基因株系相比對(duì)照受體‘cqj-5’株系的染色程度大部分都有顯著性的加深。

2.2 棉花莖稈木質(zhì)素總量測(cè)定分析

通過(guò)木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品參與得到標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果，用Excel計(jì)算得回歸方程：y=312.941x- 9.565(R2=0.999 175，y為待測(cè)液質(zhì)量濃度，x為待測(cè)液吸光度值)。將對(duì)照受體株系‘cqj-5’和‘lrp1’～‘lrp29’系列的每一個(gè)棉花株系的莖稈進(jìn)行木質(zhì)素總量測(cè)定，數(shù)值帶入回歸方程中。結(jié)果表明(圖6)，轉(zhuǎn)基因株系中的‘lrp13’‘lrp15’‘lrp16’‘lrp18’和‘lrp29’株系相比對(duì)照受體‘cqj-5’株系的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有出現(xiàn)顯著性的增減差異，‘lrp19’株系的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)顯著性的減少現(xiàn)象，其他23個(gè)株系均與對(duì)照受體株系‘cqj-5’的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著性增加，其中‘lrp17’株系木質(zhì)素的表達(dá)量最高。

a.初生木質(zhì)部 Primary xylem;b.初生韌皮部 Primary phloem；刻度尺為10 μm The scale is 10 μm;下圖3和圖5同此 Fig.3 and Fig.5 are the same

圖1 電子顯微鏡10×物鏡下的35～55 d轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質(zhì)素組織化學(xué)染色分析
Fig.1 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of cotton stalks of 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and recipient strain ‘cqj-5’(CK) under electron microscope 10×objective

數(shù)值是3次生物學(xué)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，星號(hào)表示明顯不同于對(duì)照受體cqj-5(P<0.05)，下同 Values are “mean ± standard” deviation of three biological replicates,and asterisks indicate significantly different from control receptor cqj-5(P<0.05).The same bellow

圖2 在電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質(zhì)素組織化學(xué)染色距離分析
Fig.2 The cross-cut lignin histochemical staining distance analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem under the electron microscope 40×objective lens

3 討論與結(jié)論

之前的研究表明，在大多數(shù)植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)次生壁的表達(dá)調(diào)控存在促進(jìn)或抑制作用[13-14]。本研究通過(guò)對(duì)棉花莖稈木質(zhì)素染色分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) GhMYB4株系相比對(duì)照受體株系初生木質(zhì)部的染色范圍擴(kuò)大、細(xì)胞層數(shù)增多，且初生韌皮部染色加深。大部分過(guò)表達(dá) GhMYB4基因株系相比對(duì)照受體株系莖稈木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，因此推測(cè) GhMYB4轉(zhuǎn)錄因子可能正調(diào)控棉花莖稈的木質(zhì)素代謝。

圖3 電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質(zhì)素組織化學(xué)染色分析Fig.3 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of cotton stalks of 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and recipient strain ‘cqj-5’(CK) under electron microscope 40×objective

圖4 在35～55 d轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質(zhì)素組織化學(xué)染色分析下的細(xì)胞層數(shù)測(cè)量Fig.4 The number of cell layers under the cross-cut lignin histochemical staining analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem

在許多植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)次生壁中的木質(zhì)素合成起到一定促進(jìn)或抑制作用。如在擬南芥過(guò)表達(dá)菊花 CmMYB1基因能夠在一定程度上抑制次生壁中木質(zhì)素的合成積累[15]。擬南芥 AtMYB58和 AtMYB63[16]，小麥 TaMYB4[17]，以及玉米 ZmMYB31和 ZmMYB46[18-19]等基因都在次生壁發(fā)育過(guò)程中調(diào)控木質(zhì)素的合成?；鹁嫠?PtMYB4[20]與 Ptmyb1[21]和桉樹(shù) EgMYB2[22]轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域中的AC順式作用元件結(jié)合，從而對(duì)木質(zhì)素的生物合成起到正調(diào)控作用；水稻 OsMYB46基因可以促進(jìn)表皮細(xì)胞木質(zhì)素和木聚糖纖維素的合成[23]；擬南芥 AtMYB46基因受NST3的調(diào)控，通過(guò)同時(shí)對(duì) AtMYB85和 KNAT7基因的多級(jí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而對(duì)次生壁的木質(zhì)素含量產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn) GhMYB4基因在陸地棉莖稈中參與次生壁木質(zhì)素的合成，本研究為進(jìn)一步探究 GhMYB4基因的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

圖5 電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉(zhuǎn)基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質(zhì)素組織化學(xué)染色分析Fig.5 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem under electron microscope 40×objective

星號(hào)表示明顯不同于對(duì)照受體‘cqj-5’(P<0.01) The asterisk indicates significantly different from the control receptor ‘cqj-5’ (P<0.01)

圖6 受體‘cqj-5’(CK)和轉(zhuǎn)基因‘lrp1’～‘lrp29’棉花株系莖稈中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)
Fig.6 Mass fraction of lignin in the stems of the receptor ‘cqj-5’(CK) and the transgenic ‘lrp1’-‘lrp29’ cotton