嚴(yán)太明，李 松，2，何治德，3，何 亮，阮會斌，何 智*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.廣元市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 廣元 628000；3.瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 瀘州 646000）

消化道發(fā)育直接關(guān)系到仔稚魚的發(fā)育與生存，以及生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的消化、 吸收和繁殖等重要生命活動[1]。消化酶活性是消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完整和功能健全的重要評價指標(biāo)[2-6]，消化酶活性的提高，可以促進水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而促進其生長發(fā)育[7]。因此，消化道發(fā)育研究能為掌握仔稚魚營養(yǎng)需求特點、 優(yōu)化投餌策略提供重要的參考依據(jù)[8]，也有助于準(zhǔn)確把握仔魚開口時間和提高仔稚魚成活率[4]。

鱸鯉（Percocypris pingi）隸屬鯉形目鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）鱸鯉屬（Percocypris），是生活在淡水中的兇猛肉食性魚類，主要分布于長江上游的干支流中[9-10]。目前，關(guān)于鱸鯉早期腸道形態(tài)發(fā)育和消化酶活性變化方面的研究未見報道。有鑒于此，本文采用形態(tài)學(xué)方法觀察了鱸鯉仔稚魚發(fā)育階段腸道形態(tài)變化過程，通過常規(guī)石蠟切片法測定了其腸道黏膜褶皺高度，運用酶聯(lián)免疫吸附法測定了鱸鯉仔稚魚腸道胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性，旨在為鱸鯉早期發(fā)育生物學(xué)和消化生理提供基礎(chǔ)資料，并為鱸鯉仔稚魚配合飼料的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源及管理

鱸鯉受精卵由國電大渡河流域珍稀魚類保護研究中心提供，于2018年4月2日孵化出膜。初孵仔魚在消毒處理后的白色塑料箱（50 cm×40 cm×40 cm）中培育，水深 20 cm 左右，水溫（20.6±0.7） ℃。當(dāng)仔魚開口攝食時進行餌料投喂[11]，每天投餌3 次（時間：08：30；13：30；18：30），每次投喂足量剪碎的 3%鹽水清洗后的水蚯蚓（Limnodrilus hoffeiteri），剪碎的長度隨日齡增加逐漸增長[12]。

1.2 樣本采集

1.2.1 腸道形態(tài)觀察樣本

全長和體重測量時間安排為 1、3、5、7、9、11、15、20、25、30、33、35、37、40、43、46、50、60、70、80 和 90 dah。參照劉亞秋等的報道[13]，采集 1、3、5、7、11、25、30、33、35、46 和90 dah 鱸鯉仔稚魚，每次隨機取30 尾個體用MS-222（濃度為20.0 mg/L）麻醉后，使用SZM 體視顯微鏡對鱸鯉進行觀察及拍照，記錄其典型的發(fā)育形態(tài)特征（以50%以上的個體進入該發(fā)育階段為準(zhǔn)）。取樣的前14 h 不投喂。同時選取307 dah 幼魚腸道樣本為對照，以確定腸道形態(tài)發(fā)育穩(wěn)定期。

用電子游標(biāo)卡尺測量魚體全長 （total length，TL，mm）（精確度0.01 mm），用吸水紙吸干魚體表水分后稱重（body weight，BW，mg）（精確度 0.000 1 g），最后采用10%的中性福爾馬林固定，用于腸道形態(tài)和腸黏膜褶皺高度結(jié)果觀察。

1.2.2 消化酶活性樣本

參照劉亞秋等的報道[13]，并結(jié)合鱸鯉仔稚魚腸道發(fā)育形態(tài)特征，選取 1、3、5、7、11、25、30、33、35、37和46 dah 鱸鯉仔稚魚樣品用于測量消化酶活性測定，每次取 60 尾。1～5 dah 取軀干；7 和 11 dah 去除頭部、尾部和背部多余的肌肉，僅保留軀干部；25 dah之后在解剖鏡下直接取出腸道。樣本分裝于經(jīng)高溫滅菌的10 個1.5 mL 離心管中，采用液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃的冰箱中，用于消化酶酶活性的測定。取樣的前14 h 不投喂。

1.3 實驗方法

1.3.1 鱸鯉腸道形態(tài)觀察

根據(jù)王永明等[14]和張臣等[15]對魚類腸道的分段方法，將鱸鯉腸道分為前腸、中腸和后腸。在解剖的過程中用佳能數(shù)碼相機（型號：DS126431）對腸道進行拍照觀察。

1.3.2 腸道黏膜褶皺高度分析

每個發(fā)育時期選取5 個鱸鯉仔稚魚樣本分離前、中和后腸用于腸道黏膜褶皺高度分析。按照常規(guī)石蠟切片法進行脫水、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅染色。對每個樣本的前、中、后腸隨機選取5 張切片，每張切片選擇6 個視野進行拍照，測定每個視野中至少5 個完整的腸道黏膜褶皺高度，取其平均值作為該腸段黏膜褶皺高度[16]。腸道黏膜褶皺高度采用形態(tài)學(xué)分析軟件（JD 801，江蘇捷達軟件工程有限公司）進行統(tǒng)計。

1.3.3 消化酶比活力測定

每個發(fā)育時期選取5 管分裝的鱸鯉仔稚魚樣本進行消化酶比活力測定。鱸鯉仔稚魚的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶比活力測定分別參照上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司研制的魚胰蛋白酶試劑盒（ml064285）、魚胰凝乳蛋白酶試劑盒（ml697451）、魚α-淀粉酶試劑盒（ml036449）和魚脂肪酶試劑盒（ml652113）操作說明書進行。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸鯉仔稚魚生長

在水（20.6±0.7） ℃[（19.2～22.6） ℃]條件下，鱸鯉初孵仔魚全長（9.94±0.54） mm，90 dah 全長（42.08±2.50） mm，全長與日齡（days，d）的生長呈線性相關(guān)。初孵仔魚體重（9.50±1.10）mg，90 dah 體重為（456.80±93.80） mg，體重與日齡（d）的生長關(guān)系為三項式。

2.2 腸道形態(tài)發(fā)育

鱸鯉初孵仔魚腸道未分化，在鰾雛形期（5 dah）腸道開始貫通，在臀鰭形成期（33 dah）形態(tài)發(fā)育穩(wěn)定，其發(fā)育過程經(jīng)歷了4 個發(fā)育階段，具體發(fā)育過程描述如下。

腸管形成期（1～5 dah）：初孵仔魚[（9.54±0.54）mm]腸道未分化，心臟搏動 133 次/min，肌節(jié)34～36 節(jié)（圖2A）。5 dah 仔魚[（12.50±0.36）mm]腸道呈直管形且貫通，卵黃囊細(xì)長，可見鰾室雛形（圖2B 和I）。腸道前部膨大期（11 dah）：腸道前部膨大顯著呈上翹形態(tài)（圖2II）。此時，仔魚脊椎形成，尾椎斜向上翹，背鰭褶前端隆起，背鰭原基呈三角形，尾鰭褶開始分化，邊緣呈波紋狀（圖2C）。

腸道折點發(fā)育完成期：30dah 仔魚[（21.96±1.21） mm]腸道中部出現(xiàn)明顯上翹，腸道出現(xiàn)第一個折點（圖2III）。33 dah 仔魚[（23.56±1.33） mm]腸道呈“Z”形，形態(tài)上出現(xiàn)第二個折點，可分為前腸、中腸和后腸（圖2IV）。

腸道形態(tài)發(fā)育穩(wěn)定期：35～90 dah[（24.02±1.26）～（42.08±2.50） mm]，腸道的形態(tài)發(fā)育基本穩(wěn)定，呈“Z”形。307 dah 鱸鯉進入幼魚期（圖2H），稚魚和幼魚腸道形態(tài)差異不明顯。

2.3 腸道黏膜褶皺高度

如表1所示，鱸鯉仔稚魚（5～46 dah）的黏膜褶皺高度呈現(xiàn)前腸＞中腸＞后腸的變化趨勢。背鰭形成期（30 dah，腸道出現(xiàn)第一個折點）時，前腸的黏膜褶皺高度[（618.96±48.63） μm]是背鰭形成期[25 dah，（343.15±25.92） μm，腸道呈直管形]的 1.8 倍，此后，隨著個體發(fā)育仍呈逐步增高的趨勢。中腸及后腸的黏膜褶皺高度變化趨勢與前腸相似。

表1 鱸鯉腸道黏膜褶皺平均高度分析Table 1 Analysis of average height in intestinal mucosal fold of P.pingi

2.4 消化酶活性

在水溫（20.6±0.7） ℃條件下，鱸鯉初孵仔魚均能檢測到胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶比活力。4 種消化酶比活力在整個早期發(fā)育階段呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

出膜后胰蛋白酶比活力迅速上升，在鰾雛形期（5 dah）胰蛋白酶比活力出現(xiàn)第一個峰值[（381.86±106.30） U/mg protein]（P＜0.05）。之后，在腸道前部膨大的過程中，胰蛋白酶比活力再次迅速上升，而在腸管加粗的過程中呈下降趨勢。在背鰭形成期（25 dah）時達到最低值[（223.87±62.01） U/mg protein]，與孵出期仔魚的胰蛋白酶比活力水平相似（P＞0.05）。在腸道形態(tài)發(fā)育完成過程中（30～37 dah）胰蛋白酶比活力呈上升趨勢，并在腹鰭形成期（37 dah）時達到最大值[（438.72±18.27） U/mg protein]（P＜0.05）（圖3A）。

胰凝乳蛋白酶比活力在孵出期-臀鰭形成期[（1～33） dah]差異不顯著（P＞0.05）。腹鰭形成期（35 dah）之后，胰凝乳蛋白酶比活力顯著增加到（16.91±3.64×10-3） U/mg protein，此后，胰凝乳蛋白酶比活力一直處于下降的趨勢（圖3B）。

α-淀粉酶比活力在孵出期-背鰭形成期（1～25 dah）差異不顯著（P＞0.05）。在臀鰭形成期時，α-淀粉酶比活力達到峰值（0.08±0.01） U/mg protein（圖3C）。之后，α-淀粉酶比活力逐漸下降，在稚魚期時，比活力[（0.04±0.01） U/mg protein]與孵出期仔魚相似（P＞0.05）。

脂肪酶比活力在孵出期-背鰭形成期差異不顯著（P＞0.05）。而在臀鰭形成期（33 dah）時顯著增加，達到峰值[（0.12±0.02） U/mg protein]（P＜0.05）。隨后脂肪酶比活力又逐漸下降，之后一直維持在（0.06±0.01)U/mg protein 水平（圖3D）。

3 討論與小結(jié)

魚體內(nèi)消化酶的發(fā)生并不是完全同步的，而是隨著個體生長發(fā)育而演變[17]。研究個體發(fā)育過程中消化酶活性的變化對掌握仔稚魚的營養(yǎng)需求、 制定投喂策略、 優(yōu)化商業(yè)餌料的營養(yǎng)成分和提高成活率至關(guān)重要[5，18-19]。與紅鰭笛鯛[5]（Lutjanus erythopterus）、日本鬼鮋[19]（Inimicus japonicus）、達氏鰉[2]（Huso huso）和鯉[20]（Cyprinus carpio）等的研究結(jié)果類似，本研究中胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶比活力在鱸鯉腸道未分化（1 dah，孵出期）時就能檢測到，具備了消耗內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)的能力，這表明鱸鯉消化酶的發(fā)生受自身基因的調(diào)控，而并非是餌料所誘導(dǎo)[17，21-22]。

圖3 鱸鯉仔稚魚胰蛋白酶（A）、胰凝乳蛋白酶（B）、α-淀粉酶（C）和脂肪酶（D）比活力Figure 3 the activity of trypsin（A），chymotrypsin（B），amylase（C） and lipase（D） in P.pingi

本研究中，鱸鯉胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶比活力整體上呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，而這種變化規(guī)律被認(rèn)為是脊椎動物包括魚類個體發(fā)育的一個明顯特征[23]。這種類似的現(xiàn)象在尖吻鱸[24]（Lates calcarifer）、豹紋喙鱸[25]（Mycteroperca rosacea）和雙斑絢鲇[26]（Ompok bimaculatus）等魚類中也存在。在鱸鯉腸道貫通且腸道黏膜褶皺出現(xiàn)（5 dat，鰾雛形期，開口攝之前）時，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶比活力呈上升趨勢，這可能是由于仔魚從內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)化前，增強仔魚消化酶活力，為提升自身消化能力的準(zhǔn)備[27]。此外，與斑馬魚[28]（Barchydanio rerio）、緋小鯛[29]（Pagellus erythrinus）和鯊鯛[30]（Diplodus puntazzo）等的報道類似，鱸鯉在腸道形態(tài)變化之前，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶比活力呈下降趨勢，而在腸道形態(tài)變化過程中，腸道黏膜褶皺高度顯著增加，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶比活力顯著增加。這表明，鱸鯉腸道形態(tài)發(fā)育過程中，需要大量可溶性蛋白質(zhì)的積累[13，31]，從而為適應(yīng)消化道結(jié)構(gòu)變化和功能的完善做足準(zhǔn)備。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鱸鯉腸道發(fā)育未完善之前，α-淀粉酶比活力呈逐漸上升的趨勢，之后隨著腸道發(fā)育的逐漸完善而比活力也逐漸降低，類似的研究結(jié)果在日本鬼鮋[19]等其他肉食性魚類中也有報道。此外，在尖吻鱸和大黃魚（Pseudosciaena crocea）腸道發(fā)育完善的過程中，α-淀粉酶比活力也會出現(xiàn)下降的趨勢[23，32]。這些結(jié)果表明，α-淀粉酶比活力的變化與腸道發(fā)育完善程度有著密切聯(lián)系。隨著腸道功能的完善，鱸鯉的食性也在開始進行逐步的轉(zhuǎn)換。

本研究中鱸鯉脂肪酶比活力呈現(xiàn)先上升后下降，最后進入平臺期穩(wěn)定的變化規(guī)律。在鱸鯉腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)變化過程中，腸道黏膜褶皺高度顯著增加，脂肪酶比活力顯著上升，而在結(jié)構(gòu)基本完善后，脂肪酶比活力趨于穩(wěn)定。鱸鯉脂肪酶比活力的這種變化趨勢，與泥鰍[33]（Misgurnus anguillicaudatus）和瓦氏黃顙魚[34]（Pelteobagrus vachelli）的研究結(jié)果相似，這可能是受食物攝入量變化和可溶性蛋白沉積影響[35]。而鱸鯉脂肪酶是否是腸道消化酶中最早穩(wěn)定的，其是否可以作為腸道發(fā)育完善的指標(biāo)，還需要進一步探討。

綜上，在鱸鯉仔稚魚在發(fā)育過程中，胰蛋白酶比活力顯著高于胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的比活力，表明鱸鯉對蛋白質(zhì)具有較高的消化能力，故建議在鱸鯉仔稚魚階段多投喂動物性或高蛋白水平的餌料。同時，鱸鯉在背鰭形成期-臀鰭形成期（30～33 dah）期間，腸道的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)變化最大，消化酶比活力也成顯著上升的趨勢。此后，腸道發(fā)育完善，α-淀粉酶活力顯著降低，脂肪酶比活力趨于穩(wěn)定。這就提示，在培育苗種的過程中應(yīng)該加強腸道形態(tài)變化階段食物營養(yǎng)的供應(yīng)，優(yōu)化投餌策略。