朱海珍 陳瑾文 許艷 薛斌斌 王鑫濤 鄧日林 田仁云 陳生穩(wěn) 王靜靜 黃湘

摘? ?要：NDV感染肝癌細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，在NDV感染肝癌細(xì)胞Huh7之后，能夠誘導(dǎo)一種去泛素化酶USP18的表達(dá)顯著上調(diào). 為了探究USP18在NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡過程中起什么作用，以肝癌細(xì)胞系Huh7為實驗體系，以western blot蛋白免疫印跡和定量PCR為主要方法. 在細(xì)胞中過表達(dá)USP18，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，這表明USP18具有抗癌的功能.反之，敲低細(xì)胞中USP18的表達(dá)水平，能夠有效地抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡.進(jìn)一步揭示了USP18促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制，USP18上調(diào)了定位于線粒體上的Bax的蛋白水平，Bax能與Bak在線粒體外膜上形成孔道，增加線粒體外膜的通透性，從而促進(jìn)凋亡蛋白細(xì)胞色素C的釋放.同時，USP18還能誘導(dǎo)NOXA切割效應(yīng)凋亡蛋白Caspase-7，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡.此外，USP18上調(diào)干擾素刺激基因ISG12a（IFN-stimulated gene 12a）的蛋白水平，抑制ISG12a的泛素化降解，這也是從另一個角度解釋了其促進(jìn)凋亡作用.

關(guān)鍵詞：線粒體;肝癌細(xì)胞;USP18;NDV;細(xì)胞凋亡;Bax;NOXA;ISG12a

中圖分類號：Q71 ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

USP18 Promotes Apoptosis of Liver Cancer Cells Induced by NDV

ZHU Haizhen1，2，3，CHEN Jinwen1，2，3，XU Yan1，2，3，XUE Binbin1，2，3，WANG Xintao1，2，3，

DENG Rilin1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，WANG Jingjing1，2，3，HUANG Xiang1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha? 410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha? 410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha? 410082，China）

Abstract：? After NDV infects the liver tumour cell，USP18 （Ubiquitin Specific Protease 18） acts as a deubiquitin enzyme and cleaves ubiquitin from ubiquitinated protein substrates. NDV infection of liver tumour cell can induce the apoptosis of cancer cells. Infection with NDV up-regulates the expression of USP18，and the role of USP18 in the apoptosis induced by NDV was investigated. In this study， the liver tumour cell line Huh7 is taken as the system， and western blot and qualitative PCR are considered. It is found that USP18 promotes the apoptosis of cancer cells induced by NDV，which demonstrates that USP18 has the anticancer function. In contrast， knock-down of USP18 inhibits the apoptosis of the cancer cells， which reveals that USP18 can positively regulate the protein level of Bax and NOXA. Consistently，overexpression of USP18 enhances the permeability of mitochondrial membrane and promotes the release of CYTOCHROME C. Similarly， overexpression of USP18 increases the cleaved caspase-7 and strengthens the apoptosis as well. It is also found that USP18 can upregulate the protein level of ISG12a（IFN-stimulated gene 12a）. It attenuates the ubiquitination degradation of ISG12a. The findings in this research provide a profound influence and a new insight towards treatment for liver cancer.

Key words： mitochondria;liver cancer cell;USP18;NDV;cell apoptosis;mitochondria;Bax;NOXA;ISG12a

細(xì)胞一旦生長增殖不受調(diào)控，就會不受約束的擴(kuò)增，我們稱之為“脫韁之馬”. 無限增殖之后，將會形成腫瘤，腫瘤一旦惡化轉(zhuǎn)移，變?yōu)閻盒阅[瘤，我們稱之為“癌”. 肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是我國死亡率位居第二的惡性腫瘤.

目前，國內(nèi)外許多學(xué)者都在孜孜不倦地研究抗癌治療手段，到現(xiàn)在為止，普遍的治療手段有手術(shù)切除、放射性治療、化學(xué)治療以及免疫治療等. 免疫治療是一個概念性的突破，開創(chuàng)了一個新的時代，著力于促進(jìn)機(jī)體免疫功能正?；? 只要機(jī)體的免疫功能趨于正常化，能夠被調(diào)動，機(jī)體最終就能夠依靠自身的免疫功能清除腫瘤，殺死腫瘤，達(dá)到一個抗癌的效果.

肝癌是病死率最高的幾大惡性腫瘤之一[1]. 中國每年大約有38萬多人死于肝癌以及其連帶疾病，這給我們國家的人民和社會帶來了殘酷的挑戰(zhàn)和沉重的負(fù)擔(dān). 而慢性肝臟炎癥的持續(xù)發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化便可導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生. 肝炎可導(dǎo)致肝硬化、肝纖維化、肝癌等對國人的健康和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展均帶來了強(qiáng)烈的沖擊和嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[2].

HBV慢性感染是我國HCC重要的成因. 我國臨床上90%以上的肝癌患者都攜帶HBV病毒. HBV一旦形成慢性感染，便很難從機(jī)體內(nèi)徹底清除[3-5]. 因為HBV的核酸會在體內(nèi)修復(fù)形成共價閉合環(huán)狀DNA，整合到宿主的細(xì)胞核內(nèi)，定位于基因組中，跟隨宿主的遺傳物質(zhì)一起復(fù)制，結(jié)構(gòu)類似于質(zhì)粒[6-7].

另外，除了HBV慢性感染以外，還有一類導(dǎo)致肝癌發(fā)生的疾病，那就是代謝性的肝病，代謝性肝病是一大類，包括肝-豆?fàn)詈俗冃?、遺傳性血色病、抗胰蛋白酶缺乏、非酒精性脂肪肝、遺傳性酪氨酸血癥、糖原累積病和脂類累積病等[8-11].

然而調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性程度，凋亡趨勢的分子主要有兩大類，一類是抑制肝癌細(xì)胞凋亡的基因，一般來說會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖;而另一類則是促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)基因，比如p53，細(xì)胞色素C等.細(xì)胞凋亡的一類核心成分是半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，細(xì)胞凋亡就是由蛋白酶的級聯(lián)放大切割過程所引發(fā)[12-15].

據(jù)文獻(xiàn)記載，一般比較公認(rèn)的觀點是細(xì)胞凋亡途徑主要分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑.細(xì)胞外源性途徑當(dāng)中，死亡受體和死亡配體相互結(jié)合，然后死亡受體被激活，它的死亡結(jié)構(gòu)域再跟細(xì)胞內(nèi)的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)合，傳遞死亡信號. 接下來轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如FADD再與Caspase-8酶原的DED連接，這時能夠形成誘導(dǎo)死亡的一種復(fù)合物，這時Caspase-8被激活，活化的Caspase-8裂解BID，上調(diào)Bax和Bak，促進(jìn)在線粒體上形成孔道，使線粒體膜的通透性增加，進(jìn)而釋放凋亡蛋白細(xì)胞色素C，或者作用于下游的其他Caspase，活化的這些Caspase可以切割胞核內(nèi)底物DNA修復(fù)酶PARP，導(dǎo)致cleaved PARP失去對DNA脫氧核糖核酸的修復(fù)功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡[16]. 另外，細(xì)胞內(nèi)源性途徑中，一些內(nèi)源性的死亡信號，包括DNA損傷、有毒化學(xué)物質(zhì)、Bax、原癌基因抑制劑、物理射線、能量通貨ATP耗竭等，這些細(xì)胞損傷死亡信號誘導(dǎo)線粒體釋放大量細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，之后激活A(yù)PAF-1[17-20].接下來Cyt-C，APAF-1以及procaspase-9會形成一個所謂的凋亡小體.隨后經(jīng)過Caspase家族的一個級聯(lián)放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡[17，21-23].

在本課題研究中，我們用NDV感染肝癌細(xì)胞Huh7，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP18的表達(dá)顯著升高. 過表達(dá)USP18能夠促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 反之，敲低USP18的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的凋亡.所以接下來進(jìn)一步探究其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制.我們發(fā)現(xiàn)，USP18的表達(dá)上調(diào)了Bax和NOXA，增加了線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放以及促進(jìn)NOXA切割凋亡蛋白Caspase-7，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡.此外，USP18還能上調(diào)ISG12a的蛋白水平，而ISG12a經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)，是能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，這也就從另一個角度解釋了USP18能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制.

1? ?材料與方法

1.1? ?細(xì)胞系

Huh7 細(xì)胞是實驗室從American Type Culture Collection購買.

1.2? ?試? 劑

IFN-α（Roche），DMEM培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Gibco），1×PBS（Hyclone），胰蛋白酶（Gibco），Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara），SYBR Green master 定量PCR試劑盒 （Roche），RIPA 裂解液（Thermo），蛋白酶抑制劑（Merck），USP18，PARP，Bax，細(xì)胞色素C，NOXA，Caspase-7，ISG12a等抗體（Cell Signaling Technology），β-actin抗體（Sigma）.

載玻片和蓋玻片（SPI Supplies），PVD膜（Bio-Rad），10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)盤（Corning），60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning），6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning），1.5 mL離心管（Corning），200 μL RT-PCR八聯(lián)管（Axygen）.

1.3? ?儀器設(shè)備

-80 ℃超低溫冰箱（Thermo），-20 ℃冰箱（Haier），4 ℃冰箱（中科美菱），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），流式細(xì)胞儀（Beckman），超凈生物安全柜（AIRTECH），細(xì)胞計數(shù)儀（Beckman），液氮罐（Thermo），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），紫外分光光度計（Bio-Rad），分析天平（上海天平儀器廠），超純水儀（Millipore），實時熒光定量PCR儀（Eppendorf），PCR儀（Eppendorf），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）.

1.4? ?質(zhì)粒構(gòu)建

從Huh7細(xì)胞中提取總RNA，測得其RNA濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以之為模板，PCR擴(kuò)增USP18，瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR產(chǎn)物.PCR產(chǎn)物與載體p3×FLAG-CMV-vector 分別雙酶切，再次瓊脂糖凝膠電泳，回收純化，之后T4連接酶16 ℃連接過夜，第二天用感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化.挑單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒. 質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，片段正確. 隨后質(zhì)粒經(jīng)過生工公司測序，返回序列. 經(jīng)過DNAMAN比對，目的基因的序列與USP18吻合. 經(jīng)過表達(dá)鑒定，質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中表達(dá).

構(gòu)建USP18沉默質(zhì)粒，首先在USP18開放閱讀框（ORF）中選取以AA開頭長度為21 nt的靶序列.然后依據(jù)靶序列設(shè)計長度為 63～64 nt 的 Top 鏈和 Bottom 鏈，這兩條引物鏈退火結(jié)合后連入 pRNAT-U6載體，得到 pRNAT-U6-USP18沉默質(zhì)粒，測序鑒定插入序列正確.過表達(dá)質(zhì)粒引物和沉默質(zhì)粒靶序列分別如表1和表2所示.

1.5? ?蛋白免疫印記

利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer裂解液裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞總蛋白.根據(jù)試劑盒說明書方法用 BCA 堿性硫酸銅法測定蛋白質(zhì)濃度. 蛋白樣品用2×Laemmli Sample Buffer進(jìn)行稀釋，100 ℃加熱 5 min. SDS-PAGE凝膠電泳，采用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上之后，以牛奶封閉1 h，再加入適當(dāng)?shù)囊豢故覝胤跤? h或4 ℃過夜.二抗選用goat-anti-mouse或goat-anti-rabbit抗體室溫孵育3 h. 隨后將膜置于化學(xué)放光信號檢測儀（曝光機(jī)）上加入預(yù)先配制好的顯影液（Thermo）曝光適當(dāng)?shù)臅r間，得到顯影圖像.

1.6? ?實時熒光光定量PCR

用TRIzol reagent（Invitrogen，Carlsbad CA）提取細(xì)胞中的總RNA.隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.接著用SYBR Green master（Roche）進(jìn)行實時熒光光定量PCR.檢測USP18，ISG12a等基因的mRNA水平.

1.7? ?統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel進(jìn)行處理分析，對照和處理組之間的顯著性差異分析我們采用雙樣本等方差假設(shè)雙尾的 Student t-test .*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001指示顯著性差異程度，其中P小于0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)意義.

1.8? ?線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的提取

6孔板收樣. 200 μL胰蛋白酶消化3 min ，之后加入1 mL 的PBS吹散.把樣品轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心，950 rcf（相對離心力），3 min. 加入150 μL的MIB（事先配置好），重懸.靜置于冰上，15 min. 用1 mL的注射器吹打30～50次，1 000 g，4 ℃離心10 min. 吸取上清于新的離心管中，進(jìn)行二次離心. 最大轉(zhuǎn)速離心，10 min，4 ℃.再次吸取上清于新的離心管中，這就是胞漿中的蛋白. 沉淀為線粒體，這時可以加入RIPA buffer裂解，靜置幾分鐘，提取線粒體中的細(xì)胞色素C.

2? ?結(jié)? 果

2.1? ?NDV感染肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)USP18的表達(dá)

Huh7細(xì)胞系是一種惡性肝臟腫瘤細(xì)胞，是由Kaneko等人[24]建立起來的，該細(xì)胞系源自一個日本男性高分化肝細(xì)胞肝癌.

NDV除了可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞之外，還可通過改變腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，來殺傷腫瘤細(xì)胞. 因此，它是一種有著很大發(fā)展前景的抗癌生物制劑. 我們發(fā)現(xiàn)，用NDV感染Huh7細(xì)胞后，在36 h的時候，USP18的mRNA水平有一個顯著地上調(diào)（圖1）. 然后同樣提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過蛋白免疫印跡方法檢測，我們發(fā)現(xiàn)在NDV感染36 h的時候，USP18的蛋白水平也有一個顯著地提高（圖2）.這些結(jié)果顯示，USP18在NDV感染肝癌細(xì)胞的過程中很可能有著某種作用，在感染36 h的時候，細(xì)胞進(jìn)入一個凋亡階段，而恰恰在這個時候，USP18的表達(dá)水平顯著提高，這也就意味著USP18在細(xì)胞凋亡的過程中可能起著某種暫時未知的作用.接下來我們將繼續(xù)探討USP18究竟在細(xì)胞凋亡過程中起著什么樣的作用.

2.2? ?USP18促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡以及其

機(jī)制研究

由前面研究可知，在NDV感染肝癌細(xì)胞Huh7之后，36 h的時候檢測到USP18在信使RNA水平和蛋白水平都有一個顯著地上調(diào).所以，接下來我們就要一起來探討一下USP18在肝癌細(xì)胞凋亡過程中的功能.先構(gòu)建了USP18的過表達(dá)質(zhì)粒以及沉默質(zhì)粒，并在Huh7細(xì)胞系當(dāng)中，轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的過表達(dá)質(zhì)粒以及沉默質(zhì)粒，過表達(dá)質(zhì)粒和沉默質(zhì)粒均達(dá)到預(yù)期效果（圖3和圖4）. 然后，我們用該質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實驗. 同樣，在Huh7細(xì)胞中，過表達(dá)USP18可以促進(jìn)NDV所誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡（圖5，圖6）.

細(xì)胞內(nèi)的DNA包括細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)上的DNA以及胞漿內(nèi)線粒體中的DNA，在細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序之后，染色質(zhì)會發(fā)生濃縮，形成染色體，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300 kb的DNA大片段，或是180～200 bp的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形的電泳圖（稱之為DNA ladder）. 細(xì)胞經(jīng)過處理后，采用SV buffer試劑盒分離提純細(xì)胞的總DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用核酸染料溴化乙啶（EB）染色，在凋亡的細(xì)胞亞群中可觀察到典型的DNA ladder.

因此，我們在Huh7細(xì)胞中，過表達(dá)USP18之后用NDV感染細(xì)胞36 h，然后提取細(xì)胞中的總DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳. 電泳結(jié)果顯示，USP18促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了DNA ladder，增強(qiáng)了DNA的片段化（圖5），在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)p3×flag-USP18-CMV，隨后感染NDV，在感染36 h的時候，提取細(xì)胞的總蛋白，對其進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，檢測到胞核內(nèi)底物DNA修復(fù)酶PARP被切割的程度明顯增強(qiáng)，這意味著USP18顯著地促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡.

而與之相反，在Huh7細(xì)胞系中沉默USP18，在一定程度上反過來抑制了細(xì)胞的凋亡，跟之前的結(jié)果在邏輯上是一致的（圖7）.

細(xì)胞內(nèi)的DNA，這包括細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)上的DNA以及胞漿內(nèi)的線粒體中的DNA，在細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序之后，染色質(zhì)會發(fā)生濃縮，形成染色體，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300 kb的DNA大片段，或是180～200 bp的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形的電泳圖（稱之為DNA ladder）. 細(xì)胞經(jīng)過處理后，采用SV buffer試劑盒分離提純細(xì)胞的總DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用核酸染料溴化乙啶（EB）染色，在凋亡的細(xì)胞亞群中可觀察到典型的DNA ladder.

因此，在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)USP18之后用NDV感染細(xì)胞36 h，然后提取細(xì)胞中的總DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳. 電泳結(jié)果顯示，USP18促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了DNA ladder，增強(qiáng)了DNA的片段化（圖5）.

經(jīng)過之前的研究，已經(jīng)得出結(jié)論，USP18能夠促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 那么，它是通過什么樣的方式促進(jìn)這一過程的呢？我們知道凋亡蛋白Caspase-8被激活之后裂解Bid，從而使得線粒體膜的孔道增加，通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.隨后我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)USP18能夠上調(diào)Bax的蛋白水平，同時也增強(qiáng)了細(xì)胞色素C的釋放. 此外，過表達(dá)USP18還能夠增強(qiáng)凋亡蛋白NOXA的表達(dá)，導(dǎo)致進(jìn)一步地切割效應(yīng)性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-7，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡（圖6）.

與之相反，在Huh7細(xì)胞中沉默USP18，得到與之前相反的結(jié)果.沉默USP18后，下調(diào)了Bax的蛋白水平，也就減弱了線粒體外膜的通透性，抑制了細(xì)胞色素C的釋放.與此同時，沉默USP18能夠抑制凋亡蛋白NOXA的表達(dá)，也減弱了其對于Caspase-7的切割，抑制了下游凋亡信號的激活，抑制了細(xì)胞凋亡（圖7）.

實驗數(shù)據(jù)表明，USP18是通過影響了Bax以及NOXA，從而引起線粒體膜的通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，并且通過NOXA切割Caspase-7，誘導(dǎo)下游的一系列級聯(lián)放大反應(yīng)，最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡.

2.3? ?USP18上調(diào)ISG12a的蛋白水平

ISG12a屬于一種干擾素刺激基因，具有激活機(jī)體免疫的功能. 本實驗室前期研究表明，ISG12a具有抗病毒功能，它能夠泛素化降解HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A，發(fā)揮它的抗病毒作用[25-31]. ISG12a同時還具有另外的功能，那就是可以殺傷腫瘤細(xì)胞.USP18在ISG12a的質(zhì)譜圖中存在，所以猜測USP18是不是與ISG12a存在某種聯(lián)系.? 研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞系Huh7中，過表達(dá)USP18能夠上調(diào)ISG12a的蛋白水平（圖8），反之，沉默USP18，則相應(yīng)地下調(diào)ISG12a的蛋白水平（圖9）.

因此，USP18能夠上調(diào)ISG12a的蛋白水平，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡. 那么，USP18作為一個去泛素化酶，它極有可能是通過去泛素化ISG12a，而抑制了ISG12a的泛素化-蛋白酶體途徑降解，最終達(dá)到其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的.我們做了相關(guān)的實驗，發(fā)現(xiàn)USP18能夠去泛素化ISG12a，這與我們的預(yù)期猜測是相吻合的（圖10）.

3? ?討? ?論

在NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中，有很多分子參與到了這個過程，這是一個十分復(fù)雜的調(diào)控過程.研究發(fā)現(xiàn)，ISG12a可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，而沉默了ISG12a之后的細(xì)胞卻生長得異常迅速. 于是，我們用ISG12a打質(zhì)譜分析，從中找到了一種去泛素化酶USP18.經(jīng)過檢測，在NDV感染肝癌細(xì)胞之后，USP18的表達(dá)量上調(diào)顯著，于是推測USP18在細(xì)胞凋亡過程中可能會起到某種作用.研究發(fā)現(xiàn)，USP18可以促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.換句話說，當(dāng)NDV感染細(xì)胞后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生促凋亡蛋白USP18，后者發(fā)揮著它的促凋亡功能. 進(jìn)一步研究表明了USP18促進(jìn)細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制.一方面，它可以上調(diào)Bax，增加凋亡蛋白細(xì)胞色素C的釋放;另一方面，它還能夠上調(diào)NOXA，從而促進(jìn)切割Caspase-7，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡.另外，我們研究發(fā)現(xiàn)，USP18還能夠上調(diào)ISG12a的蛋白水平，抑制它的泛素化降解.這又從另一個方面解釋了USP18的促凋亡功能，它是通過上調(diào)了ISG12a，來進(jìn)一步發(fā)揮它的抗癌功能[32-34]. 那么，USP18是如何上調(diào)ISG12a的蛋白水平的，又是如何上調(diào)Bax和NOXA的，這還有待接下來更加深入地研究，相信這將會是一個十分有意義的過程.我們的發(fā)現(xiàn)對于肝癌的防治有著積極的影響，并為臨床上的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的作用

靶點.

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