微型人胰島素基因載體的構建及其在花生中的表達

仵陶　安勝軍　邵鐵梅　朱正歌　焦展　劉培　李雪

摘要：制備和培養(yǎng)含微型人胰島素基因的轉基因花生植株，從而利用轉基因花生表達微型人胰島素。首先按照植物偏愛密碼子設計合成了修飾C肽的微型人胰島素基因（mini insulin，MI），其中胰島素B鏈通過丙-丙-賴三肽和A鏈相連接，在表達載體pBI121上構建了由花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動子驅動表達微型人胰島素的重組質粒RIG。質粒RIG經農桿菌介導法轉化至花生胚和去胚子葉中，抗生素篩選得到轉基因花生苗，之后利用PCR和Western-blot對轉基因花生幼葉進行分子生物學鑒定。結果顯示，試驗優(yōu)化了農桿菌介導的花生轉基因技術，并且得到了轉基因花生苗;分子生物學技術鑒定結果顯示，微型人胰島素基因成功轉入花生葉片基因組中，且在花生葉片中表達，其中以花生胚為外植體長出的再生苗的陽性檢測率為2.27%。目前正在探索微型人胰島素基因在花生油體中高效表達的方法，為轉基因花生規(guī)模化生產微型人胰島素提供理論基礎。

關鍵詞：分子醫(yī)藥農業(yè);轉基因花生;微型人胰島素;載體構建;基因表達

中圖分類號： Q786? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0042-05

胰島素是在1921年由加拿大人班廷和貝斯特發(fā)現(xiàn)的一種由胰臟內的胰島β細胞分泌的蛋白質類激素，由A鏈和B鏈2條多肽鏈通過二硫鍵連接而成。胰島素參與調節(jié)糖代謝，控制血糖平衡，可用于治療糖尿病。截至2015年，全球約有4.15億人患有糖尿病，中國和印度的糖尿病患者總數(shù)最高，分別是1.1億和6 900萬人[1]。其中，Ⅱ型糖尿病占糖尿病發(fā)病率的90%[2-3]。有研究證明，對Ⅱ型糖尿病患者進行短期胰島素強化治療，可使患者的血糖快速達標，并且還可改善患者的胰島β細胞功能，使部分患者獲得較長的緩解期[4]。自2012年至2015年，每年有150萬～500萬人死于糖尿病[1]，在2014年，由糖尿病導致的經濟花費約為6 120億美元。截至2013年，各種抗糖尿病藥物有9類，其中，胰島素和胰島素類似物所占市場份額最高，治療效果也最好[5]。

現(xiàn)今人們使用的胰島素大部分都是生物合成人胰島素及其類似物[6]。重組人胰島素制備方法主要分為5類，包括酶促修飾法[7]，大腸桿菌發(fā)酵生產法（其一是A鏈B鏈合成法，其二是胰島素原合成法）[8-9]，酵母發(fā)酵生產法（丹麥諾和諾德）[10-11]，哺乳動物細胞系生產法[12]，以及轉基因植物生產法[13-16]。分子醫(yī)藥農業(yè)（轉基因植物生產法）是指通過基因工程的方法，將需要的重組蛋白基因插入到植物細胞（植物本身不表達這些重組蛋白），得到轉基因植物，然后利用轉基因植物來表達重組蛋白。分子醫(yī)藥農業(yè)表達系統(tǒng)包括生物總量表達系統(tǒng)、懸浮細胞和發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)、葉綠體表達系統(tǒng)、種子和油體表達系統(tǒng)、果實/蔬菜表達系統(tǒng)以及體細胞胚表達系統(tǒng)等[17]。其中，植物油體表達系統(tǒng)中將重組蛋白與油素蛋白融合表達，利用油相和水相不相溶易分開的特點，在后期蛋白純化過程中可以簡單快速地將重組蛋白和其他植物蛋白分開，極大地降低后期純化成本[18]。花生（Arachis hypogaea）是我國重要的油料作物[19-22]，含油量在40%～60%，利用花生油體系統(tǒng)生產重組蛋白具有很好的前景，目前這方面的研究較少。本研究探索利用轉基因花生表達重組蛋白微型人胰島素，從而為花生生產重組蛋白提供理論和技術上的準備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

植物材料：花生品種冀花2號、冀花4號、冀花0607-5由河北農林科學院糧油作物研究所花生研究室惠贈，花生品種大白沙、改良?；?號、四粒紅、拔二罐購自玉安種業(yè)公司。

工程菌株及質粒載體：根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404由筆者所在實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞購自北京博邁德生物基因技術有限公司。

試劑：卡那霉素（kanamycin）和鏈霉素（streptomycin）購自Roche公司。培養(yǎng)基所用的無機鹽購自天津市科密歐化學試劑有限公司。所用激素購自Solarbio公司。連接酶和限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。2×EasyTaq PCR SuperMix （+dye）購自北京全式金生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。蛋白檢測一抗購自美國Santa Cruz公司，檢測二抗購自美國KPL公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建 根據(jù)相關文獻報道，按照植物偏愛密碼子設計合成了修飾C肽的微型人胰島素基因（mini insulin，MI），其中胰島素B鏈通過丙-丙-賴三肽和A鏈相連接（參考國際專利WO2004/111244）。在表達載體pBI121上構建了由花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動子驅動表達微型人胰島素的序列。其中水稻信號肽RiceαAmy3SP和微型人胰島素融合基因由公司合成，在水稻信號肽和微型人胰島素之間添加胰蛋白酶識別序列Klip27。將融合基因所在質粒和PBI121質粒同樣用BamH Ⅰ雙酶切后，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，然后加入DNA Ligation Kit LONG進行連接反應，4 ℃連接過夜。第2天取連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，然后均勻涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，通過抗生素篩選，挑取長出的單菌落進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定正確的菌液送去北京中科希林測序部進行DNA測序。最終測序正確的重組質粒命名為RIG。質粒RIG結構示意圖如圖1所示。

對重組質粒RIG進行PCR鑒定所用引物見表1。

1.2.2 根癌農桿菌介導的花生遺傳體系的建立及優(yōu)化

1.2.2.1 農桿菌侵染花生去胚子葉的誘導和分化 采用液氮凍融法將RIG質粒轉化至農桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。

1.2.2.2 去胚子葉的遺傳轉化 參考耿麗麗的方法[23]略有改動。選用花生品種冀花2號、冀花4號、冀花0607-5、大白沙、改良?；?號?；ㄉず螅瑢⒒ㄉN子先置于75%乙醇中1 min，然后放入0.1%氯化汞中8 min，之后滅菌水洗4次，置于無菌濾紙上晾干;用無菌手術刀將花生2張子葉分開去胚后，將去胚子葉放在含噻苯隆的無菌蒸餾水中浸泡。棄含有噻苯隆的無菌蒸餾水，再用干凈的無菌水洗3次。將已活化的根癌農桿菌LBA4404菌液離心，4 000 r/min，5 min。棄上清后用等體積的無菌水重懸菌體沉淀，然后將花生去胚子葉浸泡于重懸液中，過夜侵染。第2天用無菌水清洗花生去胚子葉3次后，再將去胚子葉正置放于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d。2 d后，將去胚子葉轉到含50 mg/L卡那霉素的芽誘導培養(yǎng)基上，約2周后外植體上產生抗性芽;將抗性芽轉移到含30 mg/L卡那霉素的伸長培養(yǎng)基上，約2周不定芽伸長;將伸長的誘導芽轉到含30 mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上，2周左右生根，有一些生根較遲緩;將生根的小苗進行煉苗，然后移栽到含營養(yǎng)土和蛭石（營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

1.2.2.3 去胚子葉非轉基因 花生去殼消毒后用無菌手術刀將花生2張子葉分開并去掉胚，將去胚子葉正置放在芽誘導培養(yǎng)基上，2周后誘導產生不定芽;將產生不定芽的花生外植體繼代，轉移到伸長培養(yǎng)基上，約2周左右，不定芽發(fā)生伸長;將伸長的不定芽轉移到生根培養(yǎng)基上，2周左右生根;將生根的小苗進行煉苗，然后移栽到含有營養(yǎng)土和蛭石（營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

1.2.2.4 空白對照組處理 花生去殼消毒后，在無菌條件下用手術刀分開花生子葉并去掉胚，之后將去胚子葉正置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.2.5 農桿菌侵染花生胚的誘導和分化 （1）花生胚轉基因RIG。選用花生品種冀花2號，花生種子去殼消毒后，用滅菌刀將花生胚切下后放在農桿菌（使用含RIG質粒的農桿菌菌液，搖菌培養(yǎng)至菌液吸光度D=0.6）菌液中侵染15～30 min，之后無菌水洗4次，共培養(yǎng)4～6 d后，轉到含頭孢的抑菌培養(yǎng)基上生長1周，1周后分別轉到含卡那霉素（50 mg/L）和頭孢（300 mg/L）的培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上進行光培養(yǎng)，轉基因花生幼苗長到2.5 cm左右后轉到生根培養(yǎng)基使其生根（頭孢300 mg/L，卡那霉素30 mg/L）。生根后將花生苗煉苗后移栽至含有營養(yǎng)土和蛭石（體積比2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。（2）花生胚非轉基因。選用花生品種冀花2號，種子去殼消毒后，無菌條件下用滅菌刀將花生胚切下，分別置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上進行光培養(yǎng);之后轉到生根培養(yǎng)基使其生根。生根后將花生苗煉苗后移栽至含有營養(yǎng)土和蛭石（營養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

所用到的培養(yǎng)基見表2。

1.2.3 花生轉化苗的PCR鑒定 當花生轉化苗長大后，剪取花生新鮮葉片，SDS法提取葉片基因組后使用2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）進行PCR反應。檢測mini insulin基因的引物見表1，mini insulin基因長度為355 bp。

1.2.4 花生轉化苗的SDS-PAGE和Western-blot檢測 使用Tris-HCl法提取花生新鮮葉片的全蛋白，之后對提取的花生葉片全蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western-blot檢測。共制備2塊膠，所用分離膠濃度是12%，濃縮膠濃度是4%，一塊膠進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后使用考馬斯亮藍快速染液進行染色處理，另一塊膠跑完電泳后，使用PVDF膜利用半干式轉膜儀進行轉膜，轉膜結束后，TBST洗膜，4次/10 min，之后用5%奶粉溶液孵育2 h進行封閉處理。加入1 ∶ 1 000封閉液稀釋的鼠抗人insulin一抗，室溫慢搖 30 min 后，4 ℃過夜。第2天取出雜交盒，室溫慢搖2 h，TBST洗膜，5次/10 min，加入1 ∶ 5 000封閉液稀釋的山羊抗鼠二抗，室溫慢搖2 h后，TBST洗膜，5次/10 min。進入暗室進行曝光處理。

2 結果與分析

2.1 載體構建

2.1.1 重組質粒RIG的鑒定 使用引物RIF和CX35S-GUSR（表1）對構建好的質粒RIG進行PCR鑒定，結果見 圖2-A。2條引物覆蓋區(qū)域包括mini insulin的序列，目的基因長度為355 bp。使用內切酶Hind Ⅲ和Sac Ⅰ對構建好的重組質粒RIG進行雙酶切鑒定，結果如圖2-B所示。重組質粒RIG經雙酶切后獲得大片段約為11 kb，小片段約為 3.3 kb，小片段是35S啟動子驅動包括融合基因和GUS在內的總序列，酶切結果與預期相符，說明融合基因已克隆到載體PBI121上，之后的DNA測序結果進一步證實重組質粒RIG構建成功，可以進行下一步的花生轉化試驗。

2.2 根癌農桿菌介導的花生遺傳體系的建立及優(yōu)化

2.2.1 去胚子葉的遺傳轉化

2.2.1.1 轉基因去胚子葉 將花生消毒去胚后，用無菌刀片將2張子葉分開，經農桿菌侵染后正置于芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約2周后發(fā)現(xiàn)部分去胚子葉長出簇狀芽，繼續(xù)生長觀察，發(fā)現(xiàn)簇狀芽在伸長過程中會有部分發(fā)褐枯萎，有的去胚子葉的簇狀芽會停止伸長，有的去胚子葉一部分芽枯萎，剩余芽伸長長成完整植株。去胚子葉轉基因花生苗移栽后，發(fā)現(xiàn)其比非轉基因花生苗要矮小（圖3-A、圖3-B）。

2.2.1.2 非轉基因去胚子葉 將花生消毒去胚后，用無菌刀片將2張子葉分開，正置于芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約2周后發(fā)現(xiàn)部分去胚子葉長出簇狀芽和小葉，繼續(xù)生長后，簇狀芽和小葉部分有變褐枯萎現(xiàn)象，需要進一步探索原因（圖3-C）。

2.2.1.3 空白對照 將花生去胚后，用無菌刀片將2張子葉分開，正置于MS培養(yǎng)基上進行光培養(yǎng)，經過2個月生長后，1/2去胚子葉一直未誘導出芽（圖3-D、圖3-F）。圖3-D、圖3-E中所用外植體品種分別是改良海花1號、大白沙;圖3-F中是冀花2號、冀花4號、冀花0607-5。

2.2.2 花生胚的遺傳轉化

2.2.2.1 轉基因花生胚 將花生胚消毒并進行農桿菌侵染后置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上生長，待小苗長至約2.5 cm高時轉至生根培養(yǎng)基進行生根，觀察其生長的整個過程，最終花生胚全部可以長成完整植株。

2.2.2.2 非轉基因花生胚 將花生胚消毒后直接置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上生長，待小苗長至約2.5 cm高時轉至生根培養(yǎng)基進行生根，觀察其生長的整個過程，最終花生胚全部可以長成完整植株。

2.3 花生轉化苗的PCR鑒定

SDS法提取花生葉片基因組DNA，利用上下游引物RIF和CX35S-GUSR對基因組進行PCR檢測，目的基因長度是355 bp。從圖4中可知，一共獲得了6株轉基因陽性植株，分別是4號、13號、18號、19號、21號、24號，其中4號、13號、18號、19號、21號是由農桿菌侵染花生胚誘導出的轉基因花生苗，24號是由農桿菌侵染花生去胚子葉誘導出的轉基因花生苗。

2.4 花生轉化苗的SDS-PAGE和Western-blot檢測

2.4.1 SDS-PAGE檢測 融合蛋白（水稻信號肽+微型人胰島素+GUS）大小約為76 ku（圖5）。非轉基因花生植株樣品上樣量分別是10 μL（nt1）和20 μL（nt2），二者在目標區(qū)域未出現(xiàn)條帶。4號轉基因植株上樣量為5（4a）、10（4b）、20 μL（4c）;24號轉基因植株上樣量為5（24a）、10（24b）、20 μL（24c）。4號和24號轉基因苗在76 ku處有條帶，非轉基因苗此處無條帶，為了確定人胰島素是否在轉基因花生中表達，還需對轉基因花生植株進行Western-blot鑒定。

2.4.2 Western-blot檢測 圖6-A中，所有轉基因花生葉片總蛋白上樣量都是30 μL，其中轉基因植株4號和24號出現(xiàn)明顯條帶，大小正確，4號是用農桿菌侵染花生胚得到的轉基因植株，24號是用農桿菌侵染花生去胚子葉得到的轉基因植株，兩者都出現(xiàn)了條帶。正對照胰島素標準品出現(xiàn)的條帶約在5.8 ku處。圖6-B中，非轉基因花生植株樣品上樣量分別是10（nt1）、20 μL（nt2）。4號轉基因花生植株樣品上樣量分別是5（4a）、10（4b）、20 μL（4c）;24號轉基因花生植株樣品上樣量分別是5（24a）、10（24b）、20 μL（24c）;胰島素標準品上樣量是5 μL。非轉基因樣品未出現(xiàn)條帶，胰島素標準品出現(xiàn)的條帶在5.8 ku左右，24號樣品在目標區(qū)間出現(xiàn)條帶，4號樣品則不明顯，可能是由于胰島素分子發(fā)生聚合作用導致單體胰島素濃度降低。4號和24號樣品在130 ku以上區(qū)域均出現(xiàn)條帶，推測可能是有蛋白質聚合現(xiàn)象[24]。

3 討論與結論

3.1 表達載體中信號肽的作用

在植物表達載體RIG中，添加了水稻信號肽序列。根據(jù)1975年Blobel和Sabatini等提出的信號肽假說，分泌性蛋白N端序列作為信號肽，指導分泌性蛋白到內質網膜上合成，在蛋白合成結束之前信號肽被切除。現(xiàn)已確認， 指導分泌蛋白在糙面內質網合成的決定因素是蛋白質N端的信號肽，信號識別顆粒以及位于內質網膜上的信號識別顆粒受體。Chen等進行的功能性分析證明，水稻淀粉酶信號肽序列可使水稻淀粉酶在葉綠體、淀粉體、細胞壁、葉子細胞外小室和懸浮細胞中表達[25]，試驗中，選用了水稻淀粉酶的信號肽序列來引導微型人胰島素在植物中表達，一方面確保微型人胰島素可

以準確進入內質網進行合成和修飾，另一方面，觀察其在葉片中的表達情況，以利于以后進行在植物懸浮細胞中表達。

3.2 植物器官再生體系的建立

本研究中分別采用了花生去胚子葉和花生胚作為外植體，通過培養(yǎng)和篩選從而直接從植物器官再生出了轉基因花生苗，而未經過愈傷組織再生生成轉基因苗。這樣做的優(yōu)勢是：培養(yǎng)周期短，無需經過愈傷組織誘導和分化階段，大大縮短了培養(yǎng)周期;在誘導愈傷組織過程中，可能會引起體細胞無性系變異，而由植物器官直接再生可以較好地避免這一點，從而提高遺傳穩(wěn)定性。但器官直接再生體系得到的轉基因苗是嵌合體植株，需要加大篩選和檢測力度[26]。

3.2.1 農桿菌侵染去胚子葉的誘導和分化 參考耿麗麗的花生去胚子葉轉基因方法[23]，選用5種花生品種進行試驗，其中包括冀花2號花生種子15粒、冀花4號花生種子5粒、冀花0607-5花生種子5粒、大白沙花生種子15粒、改良?；?號花生種子6粒，最終獲得2株轉基因苗，這2株轉基因苗來源是冀花2號花生種子和大白沙花生種子。冀花2號花生種子中有3個去胚子葉發(fā)芽，最終只有1個去胚子葉長出轉基因花生苗，另2個去胚子葉長出的芽最終枯萎無法繼續(xù)生長，大白沙花生種子中只有1個去胚子葉發(fā)芽并最終長成轉基因花生苗，改良?；?號花生種子中有1個去胚子葉有發(fā)芽趨勢，但最終枯萎未長成，其余的或是沒有誘導出芽或是芽較小無法繼續(xù)伸長。所以冀花2號花生種子和大白沙花生種子較適合用去胚子葉轉基因法進行轉化。2株轉基因苗中有1株（24號，來源于冀花2號花生）的基因組PCR檢測陽性，之后全蛋白提取物經由Western-blot檢測后出現(xiàn)目的條帶，有1株（25號，來源于大白沙花生）的PCR檢測和Western-blot檢測皆未出現(xiàn)目的條帶，可能是嵌合體的原因。利用此方法長出的簇狀芽和簇狀葉會出現(xiàn)發(fā)褐枯萎現(xiàn)象，影響了轉基因苗的生長，目前原因不明，需要進一步探索。轉基因RIG組總共用了46?；ㄉ?，共92個外植體，其中有2個外植體成苗，2株苗里有1株PCR檢測和Western-blot都呈陽性。

3.2.2 農桿菌侵染花生胚的誘導和分化 用此方法共得到44株轉基因花生苗，其中，共有5株轉基因花生苗的葉片基因組經過PCR檢測顯示陽性，只有1株苗（30號）的全蛋白提取物經Western-blot檢測出現(xiàn)目的條帶，陽性檢測率為 2.27%，有關外源基因能否穩(wěn)定遺傳，正在進一步研究中。

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