蘭莉 葉清 楊可婕 韓巍 張嫄 王敏 黃維 曹祖威 劉宇清 陶方英 楊雪 王幼勤 李斐

貴州省人民醫(yī)院聽力中心（貴陽550001）

聽力損失的患兒中遺傳性耳聾的發(fā)病率較高。大規(guī)模分子流行病學調(diào)查顯示，我國最為常見的耳聾基因為GJB2、SLC26A4以及線粒體12SrRNA基因[1]，但遺傳性聾有很高的遺傳異質(zhì)性。我省是一個多民族省份，有些部族長期處于封閉狀態(tài),與外部交流通婚少,造成了其基因在地域上存在可能的差異性。隨著人工耳蝸植入術(shù)在貴州省的廣泛開展，應對人工耳蝸植入患兒進行常規(guī)耳聾基因突變熱點檢測，為探索新的耳聾治療方法提供理論依據(jù)。本研究對貴州省85例人工耳蝸植入術(shù)后患兒的4個常見耳聾基因的20個突變位點進行檢測及分析，旨在探討我們貴州地區(qū)CI兒童致聾基因的突變熱點和突變頻率的分布規(guī)律，為通過聾病基因診斷來預測耳蝸植入效果奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年5月～2018年10月期間單側(cè)耳行人工耳蝸植入術(shù)后于貴州省人民醫(yī)院聽力康復中心康復的85名患兒的信息（包括一般信息、母孕期情況及出生史，耳聾發(fā)病年齡、感冒發(fā)燒史、耳毒性藥物使用史、傳染病史、頭部外傷史、家族史、無智力障礙）其中男52例，女33例，年齡1歲～6歲，平均3.31±1.67歲；其中漢族49例，苗族17例，布依族10例，侗族4例，穿青族2例，土家族1例，黎族1例，仡佬族1例。其中16例有耳聾家族史；少數(shù)民族患兒中12例患兒父母有近親婚配史；所有患兒除耳聾外，排除中耳畸形，其他器官畸形，無合并其他系統(tǒng)疾病及遺傳性疾?。徽Z前聾84例，僅1例為語后聾。

1.2 研究方法

1.2.1 聽力學檢查

所有患兒均在貴州省人民醫(yī)院聽力中心進行聽力學測試。其中82例為極重度感音神經(jīng)性聾，雙側(cè)ABR反應閾[5]＞91 dBnHL，3例為重度感音神經(jīng)性聾，雙側(cè)ABR反應閾＞85dB nHL；聽性穩(wěn)態(tài)反應2 kHz及以上頻率閾值＞90 dB nHL；耳聲發(fā)射雙耳均未引出。2歲以上患兒行為測聽裸耳平均閾值＞90 dB HL；助聽聽閾2 kHz以上頻率＞60 dB HL。其中68名患兒出生時行新生兒聽力篩查雙耳未通過，10名患兒未行聽力篩查，7名患兒不詳。

1.2.2 耳聾基因檢測

向患兒家長解釋聾病基因篩查的意義和目的，讓家長了解耳聾基因檢測的必要性，其監(jiān)護人簽署知情同意書后，抽取受檢者外周靜脈血3～5 ml，送往深圳華大基因臨床檢驗中心。對其最常見的4個耳聾基因20個位點進行檢測，檢測方法采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)[4]。檢測位點如下：GJB2基因35delG、c.167delT、176-191del16、c.235delC、c.299-300delAT；GJB3基 因 c.538C＞T、c.547G＞A；SLC26A4基 因 c.281C＞T、c.589G＞A、C.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、IVS15+5G＞A、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G；線粒體12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞T。

1.2.3 影像學檢查

所有患兒均在CI術(shù)前進行高分辨顳骨CT掃描及內(nèi)聽道MR，CT掃描條件:聽皉線，層厚1mm，間隔1.5 mm，窗寬3000，窗位500。前庭水管外口與前庭總腳或峽部后中點直徑大于1.5 mm為前庭水管擴大的標準。內(nèi)聽道MR觀察迷路腔結(jié)構(gòu)完整性及內(nèi)聽道內(nèi)各神經(jīng)走行排列情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,各民族非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者組間常見基因突變攜帶率比較用χ2檢驗和Fisher精確檢驗(雙側(cè)檢驗水準a=0.05)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 85例CI患兒中，4個常見耳聾基因突變陽性總例數(shù)為25例，突變的檢出率為29.41%(25/85)(表1)。

表1 貴州省85例人工耳蝸植入術(shù)患兒常見耳聾基因檢測結(jié)果Table 1 results of common deafness genes in 85 children with cochlear implantation in Guizhou

2.1.1GJB2基因

攜帶GJB2突變患者15例，占17.65%(15/85)，其中雙等位基因突變12例，占14.12%(12/85)(c.235delC純合突變9例、c.235delC/299delAT復合雜合突變3例)；單等位基因突變2例，占2.35%(2/85)(c.235delC單雜合突變1例、c.299delAT單雜合突變1例)；1例患者攜帶c.235delC/C.919-2A＞G雜合突變，雙基因突變。檢出率最高的突變位點為c.235delC，等位基因檢出率為13.53%(23/170)。

2.1.2SLC26A4基因

攜帶SLC26A4基因突變患者9例，占10.59%(9/85)，其中雙等位基因突變2例，占2.35%(2/85)(C.919-2A＞G 純 合 突 變 1例 ，IVS15+5G→A/2168A→G復合雜合突變1例)；單雜合突變6例，占7.06%(6/85)(C.919-2A＞G單雜合突變4例、PDS2168A＞G單雜合突變2例)；1例為前述的GJB2、SLC26A4雙基因突變者。檢出率最高的突變位點為C.919-2A＞G，等位基因檢出率為3.53%(6/170)。9例患兒均未發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫大。2例SLC26A4基因雙等位基因突變及4例SLC26A4單雜合突變患者行顳骨CT檢查均提示為雙耳為前庭水管擴大。其中有5例內(nèi)聽道MR示雙耳擴大的內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊。

2.1.3 線粒體DNA12SrRNA基因

攜帶線粒體DNA12SrRNA基因突變的患兒2例，占2.35%(2/85)，其中m.1555A＞G同質(zhì)突變1例，m.1494C＞T異質(zhì)突變1例。前者患兒母親聽力差，該患兒曾因“發(fā)熱腹瀉”使用慶大霉素、后者患兒氨基糖甙類藥物使用不詳，其家族無耳聾患者。

2.1.4GJB3基因

受檢者中未發(fā)現(xiàn)攜帶GJB3基因突變。

2.2 不同民族的CI患兒常見耳聾基因突變檢出率及基因型

漢族患者常見耳聾基因突變檢出率為36.73%（18/49），少數(shù)民族為19.44%（7/36），漢族患者基因突變檢出率較少數(shù)民族患者高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.125，P=0.008);各少數(shù)民族患者四種常見耳聾基因檢出率比較見表2，可見苗族、布依族(余少數(shù)民族因總病例數(shù)較少未分別進行統(tǒng)計學分析)差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.104，P＞0.05)。漢族18例有耳聾基因突變的患者中最常見的突變位點為c.235delC，等位基因檢出率為18.37%(18/98);苗族4例基因突變中最常見突變位點為c.235delC，等位基因檢出率為14.71%(5/34);布依族2例檢出基因突變中，突變位點為PDS2168A＞G/-和m.1555A＞G同質(zhì)突變，等位基因檢出率前者占5.00%(1/20)，后者占10%（2/20）;侗族1例檢出基因突變，突變位點為m.1494C＞T異質(zhì)突變，等位基因檢出率均為12.50%(1/8)；仡佬族、土家族、黎族、穿青族均未檢出基因突變。

2.3 16例有耳聾家族史患兒的常見耳聾基因突變率為43.75%(7/16)，無耳聾家族史患者的突變率為26.09%(18/69)，前者高于后者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.021，P=0.007)。少數(shù)民族中12例父母有近親婚配史的患兒常見耳聾基因突變率為33.33%（4/12），無近親婚配的少數(shù)民族患兒常見耳聾基因突變率為12.50%（3/24），前者高于后者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.124，P=0.005)。

表2 4種耳聾基因的基因突變位點在各民族CI植入患兒中檢出率(例)Table 2 Detection rate of gene mutation sites of four deafness genes in children with CI implantation in different nationalities(case)

3 討論

人工耳蝸植入術(shù)是一種能夠幫助雙耳重度與極重度感音神經(jīng)性聾患者獲得聽覺的最有效的途徑，而基因突變作為人工耳蝸植入術(shù)后效果的影響因素之一也逐漸被研究人員關(guān)注[5]。因為在不同的地區(qū)和民族中，耳聾基因突變譜和優(yōu)勢突變不同。新疆地區(qū)漢族和維吾爾族常見耳聾基因突變檢出率分別為29.73%、8.46%[6]；廣西地區(qū)壯族、漢族突變檢測率分別為8.00%、13.04%[7]。貴州獨特的地理位置和多民族小聚居大雜居的特點為耳聾基因的研究提供了獨特的資源。本研究應用基因檢測技術(shù)，對85例人工耳蝸植入患兒進行常見耳聾基因GJB2、SLC26A4基因、線粒體DNA12SrRNA基因、GJB3基因4個基因的突變情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)85例患兒中耳聾基因突變陽性總例數(shù)為25例，突變的檢出率為29.41%，均由前3個基因突變所致，其中GJB2、SLC26A4及線粒體DNA12SrRNA基因突變率分別為 17.65%(15/85)、10.59%(9/85)、2.35%(2/85)；其少數(shù)民族中苗族、布依族分別為23.53%、20.00%，差異無統(tǒng)計學意義，考慮與各少數(shù)民族總例數(shù)較少有關(guān);漢族與少數(shù)民族的突變檢出率分別為36.73%、19.44%，差異有統(tǒng)計學意義，漢族檢出率較少數(shù)民族高，表明不同民族耳聾患兒中耳聾基因突變檢出率不盡相同。其中純合突變12例，占14.12%（12/85），推測其為引起耳聾病因；但單雜合突變9例患兒，推測其等位基因上可能同時并發(fā)GJB2、SLC26A4基因的其他稀有致聾突變位點，對于這一類患兒需要進一步采取測序的方法明確其基因突變類型和方式，這樣才能為患兒致聾原因提及其家族的遺傳咨詢提供較為明確的依據(jù)。GJB2基因突變是引起非綜合征型耳聾最常見的因素.高加索人以c.35delG最常見，猶太人以c.167delT最常見，東亞人群則以c.235delC最為常見[8]。內(nèi)蒙古張迪等[9]、沈陽曲長紅等[10]、河北秦皇島張華等[11]、揚州彭新等[12]研究報道GJB2基因突變檢出率為14.93%、21.74%、27.6%、31.7%，說明不同人種或地域的耳聾患者GJB2的突變方式和頻率存在明顯差異。本研究中85例CI患兒均為非綜合征耳聾，GJB2基因突變總檢出率17.65%，最常見的突變位點是c.235delC，等位基因檢出率為13.53%，且漢族、苗族也均以c.235delC位點突變最常見，提示c.235delC可能為貴州地區(qū)CI患兒GJB2基因的熱點突變原因。

SLC26A4基因?qū)儆陔[性遺傳。研究表明SLC26A4基因突變與Pendred綜合征(PDS)和大前庭水管綜合征(LVAS)密切相關(guān)[13]。其雙等位基因病理性突變導致耳聾表現(xiàn)為雙側(cè)、呈波動性或進行性加重的耳聾；可為先天性語前聾，也可為后天早期語后聾；顳骨C T檢測可發(fā)現(xiàn)大前庭水管或Mondini畸形等，內(nèi)聽道MR可顯示內(nèi)淋巴管或內(nèi)淋巴囊擴大。本研究對象中SLC26A4基因突變率10.59%，以C.919-2A＞G最為常見，等位基因檢出率為3.53%。國內(nèi)有學者[14]研究顯示雙側(cè)大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因突變檢出率為95.97%，單側(cè)大前庭水管綜合征的檢出率為29.41%。本研究中2例SLC26A4基因雙等位基因突變及6例SLC26A4單雜合突變患者行顳骨CT檢查均提示為大前庭水管綜合征，與前述研究相符。這提示SLC26A4基因檢測對于大前庭導水管擴大綜合征具有很高的特異性，是很重要的診斷依據(jù)[15]。由于此基因的遺傳特性，雙等位基因突變可以導致耳聾表型的發(fā)生，單雜合突變的前庭水管擴大患者可能存在未知突變，所以SLC26A4基因單雜合突變患者應進一步做基因測序明確病因。

線粒體DNA12SrRNA基因突變?yōu)榘被沁邦愃幬锩舾行悦@的遺傳因素。研究證實氨基糖苷類藥物的敏感性通常是通過母系遺傳的，其中m.1555A＞G突變是最常見的耳聾相關(guān)線粒體基因突變，m.1494C＞T突變相對較低[16]。本研究攜帶線粒體DNA12SrRNA基因突變的患兒2例，占2.35%(2/85)，其中，m.1555A＞G同質(zhì)突變1例，m.1494C＞T異質(zhì)突變1例，雖然線粒體DNA12SrRNA基因突變導致的耳聾沒有GJB2和PDS基因突變常見，但是對于這一突變類型，只要有了明確的基因診斷，應避免使用氨基糖甙類藥物以有效預防耳聾的發(fā)生。

GJB3基因是我國克隆的第一個遺傳性疾病突變基因。GJB3基因突變，分別是547A＞G和538C＞T，表現(xiàn)為語后進行性高頻感音神經(jīng)性耳聾，本研究未檢出陽性病例，證實其突變率低，和蔣琦[17]等研究一致。16例有耳聾家族史患兒的常見耳聾基因突變率為43.75%(7/16)，無耳聾家族史患者的突變率為26.09%(18/69)，前者高于后者，表明遺傳因素在有家族史的患兒中占有重要的作用。12例患兒父母有近親婚配史中的常見耳聾基因突變率高達58.33%（7/12）。少數(shù)民族中因其地域差異，近親婚配中耳聾發(fā)病率高，其基因突變陽性率較高，尤其合并耳聾家族史或近親婚配史的單雜合突變患兒應進行測序以明確遺傳病因。同時應加大宣傳，避免近親婚配及有遺傳病家族間通婚，對于分子病因明確的遺傳性聾家庭，再生育時應給予合理的遺傳咨詢，實現(xiàn)遺傳性聾的預防與阻斷。

本研究通過分析貴州省85例非人工耳蝸植入患兒4種常見與耳聾相關(guān)基因的突變位點，初步掌握致聾基因高發(fā)突變攜帶情況，GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因的C.919-2A＞G為本組患兒的高發(fā)突變位點，具有一定的代表性;不同民族耳聾患兒的耳聾基因突變譜和優(yōu)勢突變有一定差異，為下一步研究其基因突變對其聽力語言康復效果的影響打下基礎。