闞延澤 江翱 王全禾

摘要：醛酮還原酶是一類依賴NAD（P）H的氧化還原酶，在生物體內(nèi)參與了糖代謝、酮代謝和物質(zhì)運輸?shù)榷喾N生理過程。為了解黃鱔醛酮還原酶在細胞逆境脅迫中的保護作用，采用液體培養(yǎng)和斑點展示法，比較含黃鱔醛酮還原酶Eakr的重組菌株和陰性對照菌株在NaCl、Cu2+和H2O2等非生物脅迫下的存活率和生長活力。結(jié)果表明，含重組醛酮還原酶Eakr的大腸桿菌在高滲透壓、重金屬和氧化脅迫下的生存率顯著高于陰性對照，其生存活力也大大增強。提示黃鱔醛酮還原酶Eakr可能參與了細胞活性氧代謝和物質(zhì)運輸?shù)榷喾N生理過程。

關(guān)鍵詞：醛酮還原酶;非生物脅迫;存活率;耐受性

中圖分類號： S188+.3 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0159-03

醛酮還原酶（aldo keto reductase，AKR）是一類通過與輔酶NAD（P）H結(jié)合將醛酮類物質(zhì)還原為相應(yīng)醇類的的氧化還原酶。它包括16 個家族，近200個成員，在酵母、植物、哺乳動物以及原核生物中均有報道 [1]。醛酮還原酶既參與了人類細胞對外源、內(nèi)源性毒性物質(zhì)的代謝過程，也導(dǎo)致了某些重要疾病的發(fā)生與發(fā)展[2]。人類醛酮還原酶AKR7A家族的成員不僅能夠抵抗活性醛類物質(zhì)氧化毒害的作用[3]，而且還參與了活性氧代謝，是機體重要的防御酶[4-5];相反，胰臟腫瘤細胞中AKR1B10基因被抑制后可有效抑制腫瘤細胞癌變，提示AKR1B10可能參與了腫瘤形成的過程[6]。除此以外，AKRs還可以催化視黃醛還原成視黃醇，影響生物體視覺的形成[7]，并且在維持膜電位、細胞內(nèi)外滲透壓平衡以及物質(zhì)跨膜運輸?shù)确矫姘缪葜匾慕巧玔8]。植物和微生物中發(fā)現(xiàn)的醛酮還原酶似乎還是機體抵抗干旱、鹽脅迫和重金屬等非生物脅迫的重要因子[9-10]。目前，國內(nèi)外對于魚類醛酮還原酶功能的研究相對貧乏。代海艷等初步探討了黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用，發(fā)現(xiàn)該酶可有效降低丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物的毒害作用[11]。但對其是否參與了細胞重金屬代謝、鹽離子脅迫和活性氧代謝等過程尚不甚清楚。本研究擬通過對比含黃鱔醛酮還原酶Eakr菌株和空白質(zhì)粒菌株，在高滲透壓、重金屬和氧化3種逆境脅迫處理下的存活率及生長活力差異，分析黃鱔醛酮還原酶在細胞非生物脅迫中的保護作用，為深入了解黃鱔醛酮還原酶的生物學(xué)功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

供試菌株含pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒BL21菌株和 pET-28a空質(zhì)粒BL21菌株，均由長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所保存?？股亍uSO4、NaCl和H2O2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達檢測 該試驗于2016—2017年在長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所動物基因組研究室完成，將實驗室保存的pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒陽性克隆菌株在LB平板（含50 g/mL Kana）上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。在平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（含50 g/mL Kana）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)D600 nm值至約0.6時，加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。使用12%的SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白是否表達。

1.2.2 不同脅迫因子處理及存活率、生長活力展示 首先，用LB培養(yǎng)基將pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株培養(yǎng)至D600 nm至約為0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 h。取6個EP管，各加入1 mL誘導(dǎo)后菌液，同時加入NaCl，使NaCl終濃度分別為0、50、100、150、200、250 mmol/L，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h。離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體后，使用1 mL新鮮LB重懸。取10 μL菌液進行101、102、103、104、105、106……倍梯度稀釋。取50 μL稀釋后的菌液，均勻涂在LB平板（含50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 12 h。選擇菌落數(shù)目在500 以內(nèi)的平板，用菌落分析儀進行計數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算不同濃度NaCl處理后大腸桿菌的存活個數(shù)。存活率Sr=（非生物脅迫后菌落總數(shù)/空白對照菌落總數(shù)）×100%。

斑點展示法表征菌落生長活力：將不同脅迫條件處理后的菌液進行1倍、10倍、100倍、1 000倍稀釋，取5 μL點在LB平板（含 50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后將平板放入菌落分析儀中拍照并保存。將含pET-28a空質(zhì)粒菌株（WT）做以上相同處理，每個處理重復(fù)3次。

同樣采用類似方法進行CuSO4、H2O2的液體培養(yǎng)和斑點形成展示。CuSO4脅迫處理終濃度為0、2、4、6、8、10 mmol/L，H2O2脅迫處理終濃度為0、1、2、4、8、16 mmol/L。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，存活率均用“ x±s”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達結(jié)果

SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，含pET-28a-Eakr BL21陽性菌株經(jīng)誘導(dǎo)后可檢測到分子量約為38 ku的特異條帶，大小與預(yù)測Eakr分子量相符，空質(zhì)粒菌株誘導(dǎo)后未檢測到類似分子量蛋白表達。證明Eakr在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達 （圖1）。

2.2 非生物脅迫對Eakr表達菌生長的影響

將Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株同時進行NaCl脅迫處理，通過菌落計數(shù)儀記錄存活菌落數(shù)目，計算存活率并進行數(shù)據(jù)處理。高鹽環(huán)境嚴重影響大腸桿菌的存活率，隨著NaCl濃度的升高，空白質(zhì)粒菌株的存活率顯著降低，Eakr表達菌株存活率變化較小。當(dāng)NaCl濃度≥100 mmol/L時，Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株存活率差異顯著。當(dāng)NaCl濃度為 250 mmol/L 時Eakr表達菌株的存活率約為空白質(zhì)粒菌株的20倍（圖2）。斑點展示結(jié)果表明，不同濃度的NaCl脅迫對Eakr表達菌株生長影響較小，但對空白質(zhì)粒菌株影響顯著。Eakr表達菌株的生長活力明顯優(yōu)于空白質(zhì)粒菌株。這與NaCl脅迫下存活率統(tǒng)計結(jié)果吻合。說明Eakr可以提高大腸桿菌對高滲透壓脅迫的耐受性（圖3）。

Cu2+脅迫試驗發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+濃度的不斷升高，Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但空白質(zhì)粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達菌株的存活率均高于空白質(zhì)粒菌株。當(dāng)Cu2+濃度≥4 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率遠高于空白質(zhì)粒菌株的存活率，且差異極顯著。在Cu2+濃度為10 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率為空白質(zhì)粒菌株存活率的500倍（圖4）。斑點展示結(jié)果進一步證實，不同濃度Cu2+脅迫下，Eakr表達菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長旺盛，當(dāng)Cu2+濃度>8 mmol/L時，空白質(zhì)粒菌株已無明顯菌落，但Eakr表達菌株仍有部分存活，這與Cu2+脅迫下存活率統(tǒng)計結(jié)果一致（圖5）。說明Eakr的表達可提高大腸桿菌對耐Cu2+脅迫的耐受性。

比較Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株在不同濃度H2O2脅迫下的存活率發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的不斷升高，Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但空白質(zhì)粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達菌株的存活率均高于空白質(zhì)粒菌株。在H2O2濃度為16 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率為空白質(zhì)粒菌株存活率的40倍（圖6）。Eakr表達菌株和空白質(zhì)粒菌株在培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)也存在明顯差異，在不同濃度H2O2下Eakr表達菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長茂盛，在H2O2濃度≥8 mmol/L時空白質(zhì)粒菌株已無明顯菌落，但Eakr表達菌株的菌落基本完整（圖7）。說明Eakr的表達可以顯著提高大腸桿菌對氧化脅迫的耐受性。

3 討論和結(jié)論

醛酮還原酶廣泛分布于原核和真核生物中，具有多種生物學(xué)功能[12]。大部分AKR都能以醛類物質(zhì)作為底物[13]，是一類重要的解毒酶[14]。人類肝臟AKR7A可以代謝黃曲霉素等強致癌物質(zhì)，在肝臟抗氧化過程中起到關(guān)鍵作用[4];藍藻醛酮還原酶基因AKR3G1能夠催化還原脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的有毒羰基化合物[15];野生大麥表達外源基因擬南芥AKR4C9時，可以顯著提高對重金屬鉻和鹽脅迫的耐受性[16];同時在大腸桿菌中表達醛酮還原酶基因ALDRXV4，顯著提高了對高鹽、高滲透壓、重金屬和醛類物質(zhì)等非生物脅迫環(huán)境下

的耐受性[9];醛酮還原酶AKR17A1在大腸桿菌中表達，顯著提高了大腸桿菌對鎘、砷、干旱、鹽及高溫等非生物脅迫下的耐受性[17]，以上研究均顯示，醛酮還原酶在細胞非生物脅迫中起到關(guān)鍵保護作用。筆者的研究結(jié)果也證實，重組黃鱔醛酮還原酶Eakr賦予重組大腸桿菌較強的抗高滲透壓、氧化脅迫及重金屬傷害的能力。在Eakr的保護下，大腸桿菌在NaCl、Cu2+和H2O2脅迫中的生存率分別提高了20、500、40倍。這些結(jié)果提示，黃鱔體內(nèi)的醛酮還原酶可能也是一種重要的機體抵御脅迫危害的保護酶。但Eakr在生物體內(nèi)的具體作用及調(diào)控機制尚不明確，需要進一步深入研究。筆者的研究為魚類醛酮還原酶的生物學(xué)功能研究提供了參考資料。

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