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      蜂毒注射液對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響研究

      2015-12-11 01:52:42呂立國(guó)吳巧玲陳志強(qiáng)白遵光王昭輝代睿欣王樹(shù)聲
      關(guān)鍵詞:蜂針蜂毒前列腺癌

      呂立國(guó) 張 嫻 吳巧玲 陳志強(qiáng) 白遵光 王昭輝 代睿欣 王樹(shù)聲

      前列腺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第二的男性惡性腫瘤[1],確診時(shí)多為晚期,內(nèi)分泌治療后幾乎都會(huì)發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC),中位生存期短。如何延緩?fù)砥谇傲邢侔┻M(jìn)展為CRPC、如何延長(zhǎng)CRPC 生存期,是世界范圍內(nèi)的治療難點(diǎn)。中醫(yī)藥治療CRPC 逐漸成為研究的熱點(diǎn)。初步臨床研究顯示,以蜂毒為主要作用成分的蜂針療法在控制前列腺癌進(jìn)展方面有一定的作用[2],初步的實(shí)驗(yàn)研究顯示,蜂毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用[3]。本研究擬在前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究蜂毒對(duì)PC-3 細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)理,為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),為CRPC 的治療提供思路。

      1.材料和方法

      1.1 試驗(yàn)藥物 蜂毒注射液,購(gòu)于長(zhǎng)春博奧生化制藥有限公司,批號(hào):20120301。

      1.2 細(xì)胞 前列腺癌細(xì)胞PC-3 購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

      1.3 試劑 MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液(Gibco 公司);四氮甲基唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma 公司)、Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、Fluo-3AM(南京凱基生物公司)。

      1.4 儀器 多功能免疫分析儀(Perkin Elmer,VICTORTMX5),熒光倒置顯微鏡(Leica,DMI2500),流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,F(xiàn)C500)。

      1.5 方法 前列腺癌細(xì)胞用含5%FBS 的DMEM,均在37℃,5% CO2,飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)設(shè)蜂毒注射液不同濃度組和空白對(duì)照組。

      1.5.1 MTT 實(shí)驗(yàn):細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),接種至96 孔培養(yǎng)板,每孔100μl,設(shè)4 個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞貼壁后加入作用藥物蜂毒注射液,設(shè)FD1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,8μg/ml,12μg/ml,16μg/ml,20μg/ml,24μg/ml 作用到時(shí)間點(diǎn),后加入5% MTT 溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí),吸去上清,每孔加入100μL DMSO 溶液,振蕩溶解后酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm OD 值。

      1.5.2 Annexin V/PI 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:設(shè)FD1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,8μg/ml 和空白對(duì)照組,細(xì)胞接種于6 孔板中,細(xì)胞貼壁后加入藥物處理24 小時(shí),收集細(xì)胞300×g 離心5 分鐘,棄上清,加入500μL 結(jié)合緩沖液,5μL Annexin-FITC 和5μL PI 染液,避光孵育15 分鐘后上機(jī)細(xì)胞凋亡率。

      1.5.3 Hoechst33258 凋亡染色:設(shè)組和前處理同1.5.2,后加入Hoechest33258 染液,后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

      1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度:細(xì)胞接種于6孔板中細(xì)胞貼壁后加入藥物處理24 小時(shí),加入Fluo-3-Am 至10μmol/L,置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30 分鐘,收集細(xì)胞,RCF300×g 離心,去掉多余的染料。再用D-PBS 洗滌2 次,后用D-PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè),檢測(cè)熒光強(qiáng)度,以此分析Ca2+濃度。

      2.結(jié)果

      2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1 可見(jiàn),與空白對(duì)照組比較,F(xiàn)D1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml 組,OD 值無(wú)明顯差異,F(xiàn)D8μg/ml,12μg/ml,16μg/ml,20μg/ml,24μg/ml 組OD 值均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。

      圖1 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞活性的影響

      2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由圖2 可見(jiàn),與空白對(duì)照組比較,F(xiàn)D1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml 組,無(wú)明顯差異,F(xiàn)D8μg/ml 作用24 小時(shí)后細(xì)胞凋亡明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。

      圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的影響

      圖3 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的影響

      2.3 Hoechst 33258 由圖4 可見(jiàn),與空白對(duì)照組比較,F(xiàn)D1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml 組無(wú)明顯變化,F(xiàn)D8μg/ml 作用24小時(shí)后在熒光顯微鏡下能見(jiàn)凋亡細(xì)胞增多。

      圖4 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡影響(Hoechst 33258 染色)

      2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 從圖5 可以看到,在FD4μg/ml,8μg/ml 處理后,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增高,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),尤其以FD8μg/ml 組最為顯著。

      圖5 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響

      3.討論

      蜂針療法是中醫(yī)傳統(tǒng)療法,具有抗腫瘤的作用,臨床研究顯示,蜂針療法在控制前列腺癌進(jìn)展方面有明確的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分,實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)蜂毒肽對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用[3]。臨床與實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了蜂毒的療效,鑒于蜂針療法、蜂毒肽臨床應(yīng)用的局限性,我們選取了由蜂毒提取制成的已批準(zhǔn)的臨床藥品蜂毒注射液進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)研究,為進(jìn)一步拓展蜂毒的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

      本實(shí)驗(yàn)表明,蜂毒注射液在8μg/ml 以上濃度時(shí),前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖抑制明顯,進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst 33258 染色熒光顯微鏡觀察證實(shí),蜂毒注射液在8μg/ml 以上濃度,作用24 小時(shí)后細(xì)胞凋亡明顯增多,由此證實(shí),蜂毒注射液可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。

      既往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)p27、p53 是蜂毒誘導(dǎo)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的途徑之一[3]。腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理是多方面的。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,發(fā)現(xiàn)4μg/ml,8μg/ml 濃度的蜂毒注射液可以引起PC-3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高。

      鈣離子與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切。凋亡的調(diào)控由十分復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)控制,目前已知有三條主要信號(hào)通路:線(xiàn)粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路,大部分與鈣離子有關(guān)。在鈣離子信號(hào)與腫瘤細(xì)胞凋亡的三條通路中,存在相互促進(jìn)、互為因果的促凋亡蛋白酶,加速腫瘤細(xì)胞凋亡。鈣穩(wěn)態(tài)的破壞可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[4],通過(guò)升高胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度,可激活相關(guān)凋亡活化因子,可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[5]。由此推測(cè),蜂毒注射液可以導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,誘導(dǎo)其凋亡。

      本實(shí)驗(yàn)在揭示了蜂毒注射液對(duì)前列腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及部分可能的機(jī)制,為蜂毒注射液臨床治療前列腺癌提供了理論依據(jù),為CRPC 的治療提供了思路。蜂毒注射液在體內(nèi)應(yīng)用是否具有明確的作用,有待進(jìn)一步的深入研究。

      1 那彥群,葉章群,孫穎浩,等.中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南:2014 版[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:61.

      2 呂立國(guó),陳志強(qiáng),吳巧玲,等.蜂針療法治療前列腺癌的臨床應(yīng)用[J].新中醫(yī),2014,46(12):254-255.

      3 呂立國(guó),白遵光,張嫻,等.蜂毒肽對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2014,28(9):13-16.

      4 鄺祥醒,李本義.L 型鈣離子通道與前列腺癌的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2013,5(4):249-251.

      5 李玉.鈣離子通道在前列腺疾病的研究進(jìn)展[J].國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志,2009,29(3):370-376.

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