錢 迪 鄭偉昌 陳翠霞 敬光懷 湯國棟 黃俊煊

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518109）

耳聾是臨床常見的聽力損傷類型，近年來隨著臨床醫(yī)學(xué)對該病病理機制研究的不斷深入，諸多文獻研究報道從遺傳、環(huán)境、病理及藥物等因素探討了其發(fā)病機制。據(jù)最新的研究報道顯示，血管紋是轉(zhuǎn)運K+進入耳蝸內(nèi)淋巴致高鉀環(huán)境形成，并促使耳蝸內(nèi)電位（EP）產(chǎn)生的主要部位[1]；而相關(guān)動物實驗研究顯示，在大鼠耳蝸中鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1（NKCC1）、Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase） 主要于血管紋邊緣細胞基礎(chǔ)膜側(cè)分布，在維持內(nèi)耳聽力中發(fā)揮了重要的參與作用機制[2]。且NKCC1及Na+-K+-ATPase 離子轉(zhuǎn)運體活動建立起的耳蝸K+循環(huán)是EP產(chǎn)生的重要條件。C57BL/6J小鼠是已經(jīng)證實的具有典型特征的聽力損傷動物模型，本研究主要分析NKCC1與Na+-K+-ATPase 在耳蝸K+循環(huán)及中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物材料：選擇由動物中心提供的36只健康C57BL/6J小鼠為研究對象，小鼠經(jīng)近交自行繁殖培育，可保持長時間穩(wěn)定的聽力，均系小鼠12周齡，體質(zhì)量12～18 g，平均（15.32±4.26）g。所有試驗小鼠均放置低噪聲環(huán)境下進行普通飼養(yǎng)。

1.2 方法：①聽覺腦干反應(yīng)（ABR）檢測。取實驗鼠12只，予以三溴乙醇腹腔注射麻醉，用量0.53 mg/g；采用銀針電極，于頭頂正中皮下插入正極，于左耳皮下插入?yún)⒖茧姌O，于右耳皮下插入地極電極，ABR檢測儀器采用美國產(chǎn)ABR儀，刺激參數(shù)設(shè)置由電腦產(chǎn)生設(shè)定的短聲、短純音的8、16、32 kHz為刺激聲。實驗中以能分辨出ABR I波的最低刺激強度作為ABR閥值，ABR檢測3次，取平均值，作正常對照組[3]。②NKCC1抑制劑實驗及恢復(fù)實驗。取實驗鼠12只，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后，給予NKCC1抑制劑呋塞米注射，注射30 min后再予以ABR檢測，作為呋塞米實驗組。12只小鼠停藥3 d，后再次行ABR檢測，作為呋塞米恢復(fù)組。③Na+-K+-ATPase抑制劑實驗。取實驗鼠12只，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后，給予Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因注射，1次/天，連續(xù)注射5 d。第5天注射30 min后再予以ABR檢測，作為哇巴因?qū)嶒灲M。12只小鼠停藥3 d，后再次行ABR檢測，作為哇巴因恢復(fù)組。

1.3 觀察指標(biāo)：通過1.2檢測結(jié)果，對比分析對照組、呋塞米實驗組、呋塞米恢復(fù)組、哇巴因?qū)嶒灲M、哇巴因恢復(fù)組小鼠ABR閥值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：統(tǒng)計學(xué)軟件版本號為SPSS20.0，用（±s）的形式對計量檢測數(shù)據(jù)進行表示，數(shù)據(jù)之間的比較用t對其進行檢驗，P＜0.05提示數(shù)據(jù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組與實驗組小鼠ABR閥值比較：從表1可以看出，在平均ABR閥值指標(biāo)值上，給藥前，對照組、呋塞米實驗組、哇巴因?qū)嶒灲M比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥后，呋塞米實驗組、哇巴因?qū)嶒灲M平均ABR閥值均高于給藥前（P＜0.05），與正常對照組接近。

表1 對照組與實驗組小鼠ABR閥值比較（±s）

表1 對照組與實驗組小鼠ABR閥值比較（±s）

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2.2 實驗組小鼠給藥前后ABR閥值比較：從表2可以看出，停止給藥恢復(fù)后，呋塞米實驗組、哇巴因?qū)嶒灲M平均ABR閥值均低于給藥后（P＜0.05），與給藥前接近。

表2 實驗組小鼠給藥前后ABR閥值比較（±s）

表2 實驗組小鼠給藥前后ABR閥值比較（±s）

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3 討 論

本研究主要研究聽覺實驗中NKCC1與Na+-K+-ATPase 在耳蝸K+循環(huán)中的作用，其中NKCC1是參與耳蝸K+循環(huán)生理機制，對聽覺生理功能進行維護的重要功能通道[4]；Na+-K+-ATPase會引發(fā)細胞內(nèi)外的Na+濃度差，當(dāng)Na+經(jīng)該濃度差于細胞進入時，可經(jīng)本體蛋白質(zhì)運載體以共同運輸?shù)姆绞綄⑼ㄟ^細胞膜不易的物質(zhì)帶進細胞。如前文所述，血管紋是轉(zhuǎn)運K+進入耳蝸內(nèi)淋巴致高鉀環(huán)境形成，并促使耳蝸內(nèi)電位（EP）產(chǎn)生的主要部位，而在血管紋邊緣細胞底側(cè)膜的NKCC1與Na+-K+-ATPase在耳蝸K+循環(huán)中則發(fā)揮著重要的作用機制[5]。其中Na+-K+-ATPase通過3 Na+的泵出，以交換2K+轉(zhuǎn)運至邊緣細胞，促使Na+濃度梯度的形成；NKCC1則可通過對內(nèi)向性Na+濃度梯度的利用以1 Na+：1K+：2Cl-的比例將離子轉(zhuǎn)運至邊緣細胞。而經(jīng)邊緣細胞頂膜上的KCNQ1通道將K+分泌至淋巴，進而形成EP，對聽覺功能進行維持[6]。與此同時，分泌至耳蝸內(nèi)淋巴中的K+經(jīng)基底膜毛細胞與螺旋韌帶間的通道進行轉(zhuǎn)運，再次進入邊緣細胞，以此循環(huán)，構(gòu)成耳蝸K+循環(huán)機制。因此，血管紋邊緣細胞底側(cè)膜的NKCC1與Na+-K+-ATPase對K+的轉(zhuǎn)運具有限制與促進作用[7]。

本研究通過構(gòu)建動物聽覺試驗，以健康C57BL/6J小鼠為研究對象，分別設(shè)置正常對照組，NKCC1抑制劑呋塞米實驗組、恢復(fù)組，Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因?qū)嶒灲M、恢復(fù)組。結(jié)果顯示：①在平均ABR閥值指標(biāo)值上，給藥后，呋塞米實驗組、哇巴因?qū)嶒灲M平均ABR閥值均高于給藥前（P＜0.05），與正常對照組接近。即通過對NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的抑制，小鼠ABR閥值顯著升高。②停止給藥恢復(fù)后，呋塞米實驗組、哇巴因?qū)嶒灲M平均ABR閥值均低于給藥后（P＜0.05），又與給藥前接近。提示，通過對NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的恢復(fù)，小鼠ABR閥值顯著降低，且接近正常。上述兩項研究結(jié)果證實NKCC1與Na+-K+-ATPase作為離子轉(zhuǎn)運蛋白，其活性與小鼠聽覺功能密切相關(guān)。當(dāng)小鼠被注入NKCC1抑制劑呋塞米后，耳蝸血管紋邊緣細胞底側(cè)膜上分布的NKCC1活性被阻斷，其在耳蝸K+循環(huán)中所發(fā)揮的作用降低，對K+由邊緣細胞轉(zhuǎn)運至淋巴，再由淋巴轉(zhuǎn)運至邊緣細胞的循環(huán)路徑進行阻斷，致高鉀環(huán)境破壞，EP建立受阻，從而導(dǎo)致聽覺功能障礙，ABR閥值升高[8]。同時，當(dāng)小鼠被注入Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因后，耳蝸側(cè)壁螺旋韌帶纖維細胞膜上分布的Na+-K+-ATPase活性被阻斷，其在耳蝸K+循環(huán)中所發(fā)揮的作用降低，K+不能泵入，進入邊緣細胞受阻，造成進入淋巴的K+大量減少，EP建立受抑制，同樣引發(fā)聽覺功能障礙，ABR閥值升高。另一方面，據(jù)相關(guān)研究報道證實，NKCC1與Na+-K+-ATPase活性與耳蝸神經(jīng)變性密切相關(guān)。即NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的降低，損傷耳蝸微血管內(nèi)皮細胞功能，使血管基底膜厚度增加，造成微血管供應(yīng)區(qū)神經(jīng)缺氧、缺血、神經(jīng)脫髓鞘及髓鞘空泡樣改變，這是誘發(fā)耳蝸和耳蝸神經(jīng)變性的重要因素，不僅可造成聽覺功能受損，同時也是引起耳聾的主要原因。綜上，NKCC1與Na+-K+-ATPase作為離子轉(zhuǎn)運蛋白，其開展的離子轉(zhuǎn)運體活動是建立耳蝸K+循環(huán)，產(chǎn)生EP及維持聽覺功能的重要因子。