雙匯集團(tuán) 河南漯河 462003

慶大霉素是典型的由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的氨基糖苷類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有作用，可以有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖。慶大霉素?zé)岱€(wěn)定性好、價(jià)格低廉，是目前我國畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)[1]和水產(chǎn)業(yè)中[2]常用的獸藥之一，在我國畜牧養(yǎng)殖中，常被添加到飼料中，用于促進(jìn)動(dòng)物的生長發(fā)育。臨床應(yīng)用的慶大霉素會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，可能導(dǎo)致前庭和耳蝸神經(jīng)損傷，且會(huì)導(dǎo)致腎損傷，出現(xiàn)血尿、蛋白尿、腎功能減退等癥狀。農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中明確規(guī)定，豬肌肉組織中慶大霉素的最高殘留限量為100μg/kg。

近年來，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因能有效實(shí)現(xiàn)抗生素的確證和定量，成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)[3～6]。慶大霉素具有較強(qiáng)的極性，在常規(guī)反相色譜柱上的保留性較差，通常加入離子對(duì)試劑七氟丁酸以增強(qiáng)其在色譜柱上的保留性，但其對(duì)質(zhì)譜離子化具有抑制作用，降低負(fù)離子模式檢測項(xiàng)目的靈敏度。親水-親脂平衡介質(zhì)以多孔二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮為框架結(jié)構(gòu)，具有良好的親水、親脂特性及更好的穩(wěn)定性和廣泛的pH適用性，優(yōu)于其他的反相固相萃取柱，可用于極性或非極性化合物的提取、富集和凈化。

本研究擬參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21323-2007《動(dòng)物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，建立了一種固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS方法測定動(dòng)物源食品中慶大霉素的方法。該方法使用HLB固相萃取小柱對(duì)提取的樣品進(jìn)行凈化，然后使用C8色譜柱，對(duì)樣品進(jìn)行快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慶大霉素純度≥90%，Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈(質(zhì)譜純)，F(xiàn)isher公司；

甲酸(質(zhì)譜純)，F(xiàn)isher公司；

乙酸銨(色譜純)，Kermel公司；

HLB固相萃取柱(60mg，3mL)，沃特世科技有限公司；

Xevo型液相色譜四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，沃特世科技有限公司；

H-1850R型離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

KQ-5200DE型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

T18型高速勻漿機(jī)，德國IKA公司；

TARGINTM VXⅢ多管漩渦混合振蕩器，Targin公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

豬肉樣品取肌肉部分，用食品料理機(jī)勻漿，制成均勻樣品，-18℃冷凍保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

稱取適量慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(4℃避光可保存6個(gè)月)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

量取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；精密量取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用空白樣品基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

1.2.4 樣品處理

稱取試樣2.00g±0.01g于50mL離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液，振蕩20min，以7 000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)50mL離心管中，在殘?jiān)性偌尤?0mL磷酸鹽緩沖液，重復(fù)上述操作，合并上清液，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化；40℃下氮吹至近干，用1mL0.3%乙酸水溶液復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜于進(jìn)樣小瓶中，利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。

固相萃取操作流程如下。

活化：3mL甲醇、3mL水。

上樣：將提取液加載在固相萃取柱上，控制流速約1滴/s。

淋洗：3mL水。

洗脫：5mL5%甲酸甲醇溶液。

1.2.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件如下。

色譜柱：Acquility UPLC BEH C8(2.1×50mm，1.7μm)；柱溫40℃，進(jìn)樣體積5μL；流速0.2mL/min。

流動(dòng)相：A相為5mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水，B為乙腈。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件如下。

離子源為ESI，正離子模式。

掃描方式：正離子掃描。

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

毛細(xì)管電壓：0.5KV。

離子源溫度：500℃。

霧化氣流量：1 000L/h。

錐孔氣流量：30L/h。

碰撞氣為高純氬氣。

慶大霉素的定性、定量離子對(duì)，采集時(shí)間，碎裂電壓，碰撞能量如表2所示。

表2 MRM模式下慶大霉素的監(jiān)測條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于肉制品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有較高濃度的蛋白質(zhì)、脂肪及大量的內(nèi)源性化合物，干擾分析物的測定，因此必須使蛋白質(zhì)變性沉淀，同時(shí)釋放出藥物，減少基質(zhì)影響。依據(jù)慶大霉素易溶于水的性質(zhì)，三氯乙酸水溶液可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有效的提取，我們對(duì)三氯乙酸的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5%三氯乙酸-10mmol/L磷酸鹽(含4mmol/L Na2EDTA)溶液可以對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行充分提取，也可以較好地沉淀蛋白質(zhì)。提取液pH值的變化對(duì)慶大霉素的影響較大，當(dāng)調(diào)整提取上清液pH值至3.0時(shí)，回收率最好，回收率均大于65%，最高接近100%。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

慶大霉素在質(zhì)譜上具有很強(qiáng)的正離子響應(yīng)，因此選擇正離子模式進(jìn)行掃描。以1.0μg/mL慶大霉素單標(biāo)溶液進(jìn)樣分析，在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，且豐度較大，因此選擇分子離子峰作為母離子。對(duì)離子進(jìn)行轟擊碎裂，得到特征碎片離子峰信息，確定各目標(biāo)物的特征子離子，具體見表2。在MRM模式下優(yōu)化碰撞能量、裂解電壓，最后在液相色譜聯(lián)機(jī)條件下優(yōu)化噴霧電壓、離子化溫度、脫溶劑氣溫度等參數(shù)，確定了最佳質(zhì)譜檢測條件。

2.3 色譜條件的選擇

以C8色譜柱與C18色譜柱作為分析柱，通過系列實(shí)驗(yàn)，比較了Acquility UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)、Acquility UPLC BEH C8(2.1mm×50mm，1.7μm)兩種色譜柱，結(jié)果表明慶大霉素在C18色譜柱上沒有保留，在C8色譜柱上有良好保留性，因此選擇該色譜柱作為分析柱。

比較了乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲酸銨甲酸水、乙腈-乙酸銨甲酸水、甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)對(duì)色譜分離效果的影響，最終確定流動(dòng)相A為5mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水，B為乙腈時(shí)，色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)效果最佳。通過優(yōu)化梯度洗脫條件，獲得了目標(biāo)物合適的保留時(shí)間和峰形，MRM模式下監(jiān)測提取色譜圖見圖1。比較了流速0.2～0.45mL/min，對(duì)出峰時(shí)間影響不大，考慮到慶大霉素在色譜柱中保留時(shí)間，最終確定流速為0.2mL/min，出峰時(shí)間為0.5min左右。

圖1 慶大霉素的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖

2.4 方法的線性關(guān)系與檢出限

以色譜峰面積(Y)和質(zhì)量濃度(X)做線性回歸，結(jié)果顯示慶大霉素在20～1 000μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系均良好(r=0.9995)，見表3。通過陰性豬肉樣品加標(biāo)測定，慶大霉素添加水平在20、30、40μg/kg，其信噪比(S/N)均大于10，表明其定量檢測下限可達(dá)20μg/kg。

表3 慶大霉素的線性范圍和線性方程

2.5 方法的回收率和精密度考察

以均質(zhì)后的空白豬肉樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測定。慶大霉素添加20、30、40μg/kg3個(gè)水平，按所建方法進(jìn)行樣品處理和測定，平均加標(biāo)回收率和精密度見表4。結(jié)果顯示，豬肉中加標(biāo)回收率為73%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～7.7%，能夠滿足檢測方法的要求。

表4 慶大霉素的回收率和精密度

2.6 實(shí)際樣品中慶大霉素殘留檢測

采用本方法對(duì)20個(gè)豬肉樣品進(jìn)行檢測，未檢出慶大霉素殘留。

3 結(jié)論

建立了豬肉中慶大霉素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法以5%三氯乙酸-磷酸鹽緩沖液提取樣品中目標(biāo)物，以HLB柱富集凈化，有效去除了基質(zhì)干擾，提高了回收率。通過優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜檢測條件，建立的HPLC-MS/MS方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限，在實(shí)際檢測工作中具有良好應(yīng)用價(jià)值。