香菇液體深層發(fā)酵優(yōu)化研究

韓 冰 陳 順 于廣峰 王洪奇 冀寶營(yíng) 孫立梅 關(guān)艷麗 郭玲玲

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng)122000）

香菇（Lentinus edodes）隸屬于擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科香菇屬，又名香菇菌、花菇、花蕈等，是目前我國(guó)生產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的食用菌品種之一[1]，也是世界著名食藥用真菌，居全球食用菌產(chǎn)量第二位。2015年，中國(guó)香菇產(chǎn)量達(dá)767萬(wàn)t，占全球香菇總量的90%以上[2]。我國(guó)是世界上最早認(rèn)識(shí)和栽培香菇的國(guó)家之一，至今已有800多年的歷史[3]。

相對(duì)于固體菌種而言，液體菌種生產(chǎn)有工藝簡(jiǎn)便、周期短、菌種純、成本低等特點(diǎn)[4]，目前采用液體菌種栽培的食用菌已有50余種[5]。香菇作為食用菌生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，其液體種的生產(chǎn)工藝是提高香菇生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。筆者以遼西地區(qū)主栽香菇品種遼香6號(hào)為供試品種，對(duì)其深層發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為香菇液體菌種的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇菌株“遼香6號(hào)”，原種由遼寧省微生物科學(xué)研究院食用菌栽培研究室保藏。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備及培養(yǎng)基原材料

（1）主要儀器：上海舜宇恒平電子天平（MP2002型）、申安立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KB型）、超凈工作臺(tái)、中器生化培養(yǎng)箱（SPX-450型）、上海世平立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床（SPH-2102型）、Sigma離心機(jī)（3K15型）等。

（2）培養(yǎng)基原材料：葡萄糖、蔗糖、紅糖、瓊脂、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、Mg SO4·7H2O、玉米面、麩皮、木屑、石膏等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的制備與培養(yǎng)料的配制

1.3.1.1 供試菌種活化

在無(wú)菌條件下，將母種菌絲接種至PDA斜面上，25℃下培養(yǎng)7 d后挑選菌絲濃密、潔白、健壯的試管作為供試菌種。

1.3.1.2 液體菌種的制備

將每塊0.5 cm2大小的3塊菌絲塊接種至含100 m L供試液體培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基土豆10%，玉米面1%，葡萄糖1%，麩皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%）的500 mL三角瓶中，25℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3.2 液體菌種培養(yǎng)基配方的碳源、氮源篩選試驗(yàn)

1.3.2.1 碳源的篩選

以原有培養(yǎng)基配方（1.3.1.2）為基礎(chǔ)，進(jìn)行碳源的篩選，用2%玉米粉分別與1%的葡萄糖、蔗糖、紅糖組合作為碳源，添加麩皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%配制液體培養(yǎng)基；25℃，150 r/min條件下培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)。測(cè)定菌絲生物量，求平均值，篩選出最佳碳源組合。

1.3.2.2 氮源的篩選

以碳源試驗(yàn)篩選出優(yōu)勢(shì)碳源組合為氮源的篩選試驗(yàn)培養(yǎng)基碳源，以2%麩皮分別與1%的酵母粉、蛋白胨、牛肉粉組合作為氮源（添加玉米面2%，葡萄糖 1%，麩皮 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%）配制培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)。測(cè)定菌絲生物量，求平均值，篩選出最佳氮源組合。

1.3.3 液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

以篩選出的最適培養(yǎng)基配方（玉米粉2%，紅糖1%，麩皮 2%，酵母粉 1%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%）液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，裝量為每瓶100 mL，pH自然，接種斜面菌種，25℃恒溫培養(yǎng)。以搖床轉(zhuǎn)速、接種量和靜置時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表1），以菌絲生物量（濕重）為考察指標(biāo)，確定香菇液體菌種培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合。

上述試驗(yàn)取發(fā)酵液各3瓶，9193×g離心10 min，棄殘液，稱重，得菌絲生物量，取平均數(shù)。

1.3.4 液體菌種接種培養(yǎng)料試驗(yàn)

選1%紅糖和葡萄糖這兩種優(yōu)勢(shì)碳源，分別與1%牛肉粉、蛋白胨和酵母粉組合，添加玉米粉2%，麩皮2%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%為培養(yǎng)基制備香菇液體菌種，以斜面固體菌種為對(duì)照，分別接入固體培養(yǎng)料。液體菌種接種5 mL，每個(gè)配方接種5瓶；固體種接入長(zhǎng)2 cm斜面菌種2～3塊。

接種后23℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀測(cè)液體菌種和斜面固體菌種在培養(yǎng)料上菌絲萌發(fā)情況，記錄菌絲滿瓶所需時(shí)間，測(cè)量培養(yǎng)料的高度，計(jì)算菌絲的平均生長(zhǎng)速度（菌絲長(zhǎng)速=培養(yǎng)料的高度/菌絲滿瓶所需時(shí)間），觀察并計(jì)算污染率。

表1 香菇液體菌種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)的因素與水平

1.3.5 液體菌種最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

以篩選出的最適培養(yǎng)基配方、最適的液體培養(yǎng)條件培養(yǎng)液體菌種，培養(yǎng)5 d后每隔24 h取樣轉(zhuǎn)接3支試管，觀察菌種萌發(fā)及滿管時(shí)間，同時(shí)取樣3瓶測(cè)定菌絲生物量，至菌絲生物量下降結(jié)束培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源組合篩選結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見，以1%紅糖+2%玉米粉組合碳源最好，獲得香菇菌絲生物量最高，為11.35 g/100 mL，1%葡萄糖+2%玉米粉組合次之，1%蔗糖+2%玉米粉組合最低。因此，可確定1%紅糖+2%玉米粉組合為最佳碳源組合。

表2 不同碳源組合對(duì)香菇菌絲生物量的影響

2.2 氮源組合篩選結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，以氮源1%酵母粉+2%麩皮，碳源1%紅糖+2%玉米粉組合最好，獲得香菇菌絲生物量高；氮源1%牛肉粉+2%麩皮與碳源1%葡萄糖+2%玉米粉組合也能獲得較高的香菇菌絲生物量；氮源1%蛋白胨+2%麩皮與碳源1%葡萄糖+2%玉米粉組合的獲得菌絲生物量最低。因此，可確定1%酵母粉+2%麩皮，1%紅糖+2%玉米粉組合為最佳碳氮源組合，菌絲生物量為21.26 g/100 mL。

表3 不同氮源組合對(duì)香菇菌絲生物量的影響

2.3 液體菌種接種培養(yǎng)料結(jié)果

由從表4和圖1、2、3可見，1%牛肉粉+1%紅糖、1%酵母粉+1%紅糖、1%酵母粉+1%葡萄糖為碳氮源組合培養(yǎng)的液體菌種，接種固體培養(yǎng)料后發(fā)菌、吃料速度快，結(jié)合液體菌種培養(yǎng)基配方的單因素篩選結(jié)果，進(jìn)一步確定1%酵母粉+1%紅糖為最優(yōu)碳氮源組合。

表4 液體菌種在固體培養(yǎng)料上發(fā)菌情況

液體菌種為接種4 d后萌發(fā)（圖1），固體菌種未萌發(fā)，可見液體菌種萌發(fā)明顯快于固體菌種；液體菌種接種23 d后菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶（圖2）；圖3接種90 d產(chǎn)生原基及子實(shí)體（圖3左、中），而固體菌種未產(chǎn)生原基（圖3右）。由此可見，從菌種萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)到原基形成液體菌種都優(yōu)于固體菌種。

2.4 液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

極差分析表明（表5），極差值越大，在該因素水平變動(dòng)時(shí)，對(duì)香菇菌絲體生物量的影響越大。從表5可以看出，3因素的極差值大小順序是A＞B＞C，表明試驗(yàn)培養(yǎng)條件中影響香菇菌絲體生物量的最主要因素是搖床轉(zhuǎn)速。根據(jù)水平之間K值大小比較得知，最佳組合為A2B3C2。因此，試驗(yàn)最佳的香菇液體菌種培養(yǎng)條件：搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種4塊菌種、搖前靜置時(shí)間24 h。

圖1 液體菌種接種4 d萌發(fā)狀態(tài)

圖2 接種液體菌種菌絲滿瓶

圖3 固、液菌種接種90 d對(duì)比

表5 香菇液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 液體菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間

由表6可知，發(fā)酵第8天菌絲生物量最高，發(fā)酵液黏稠，回接試管菌絲萌發(fā)較快，可確定為發(fā)酵終點(diǎn)。

表6 液體菌種不同發(fā)酵時(shí)間的確定

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)確定香菇遼香6號(hào)液體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基配方：玉米粉2%，紅糖1%，麩皮2%，酵母粉1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%。最佳培養(yǎng)條件為：接種4塊菌種（每塊0.5 cm2），培養(yǎng)溫度25℃，上搖床前靜置24 h，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，以培養(yǎng)8 d為宜。

不同的香菇品種所需液體發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)有差異，需根據(jù)菌株特點(diǎn)和液體發(fā)酵目的進(jìn)行篩選。但培養(yǎng)條件卻大致相同，試驗(yàn)培養(yǎng)條件可供參考。試驗(yàn)為搖瓶培養(yǎng)結(jié)果，對(duì)于大型發(fā)酵罐是否適宜，有待驗(yàn)證。