黃琳，王殿冰，顧寧，張先恩,2,3

高效裝載細(xì)胞內(nèi)源蛋白工程化外泌體的構(gòu)建

黃琳1,2*，王殿冰2*，顧寧1，張先恩1,2,3

1 東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096 2 中國科學(xué)院生物物理研究所 中國科學(xué)院生物大分子研究中心 生物大分子國家實驗室，北京 100101 3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

外泌體作為天然藥物運(yùn)送載體具有諸多優(yōu)點，但其對細(xì)胞內(nèi)源藥物 (蛋白、核酸等) 的有限裝載限制了其應(yīng)用。文中以紅色熒光蛋白mCherry為模擬細(xì)胞內(nèi)源性貨物，通過對供體細(xì)胞的基因改造及采用膜定位元件融合策略，將mCherry富集于細(xì)胞質(zhì)膜，再經(jīng)天然發(fā)生 (Biogenesis) 途徑，高效分選進(jìn)入外泌體。結(jié)果表明，在CAAX、PB、Palm和CD63四組膜定位元件中，CD63和Palm能有效提高靶蛋白mCherry在外泌體中的裝載量。該研究可為工程化外泌體的設(shè)計、內(nèi)源蛋白等貨物的高效遞送提供參考。

外泌體，藥物運(yùn)送載體，內(nèi)源蛋白，膜定位元件，裝載效率

外泌體是一種由細(xì)胞分泌到胞外的脂質(zhì)雙層納米囊泡，尺寸介于30–150 nm[1]。研究表明，外泌體在自然發(fā)生過程中，能夠包裹細(xì)胞中的生物活性成分(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等)，并將其攜帶到相鄰或遠(yuǎn)端的細(xì)胞中發(fā)揮功能[2]，因而被認(rèn)為是細(xì)胞間通信的一類介質(zhì)[3]。此外，外泌體中的成分還能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理病理過程，反映細(xì)胞狀態(tài)變化[4-5]。這些性質(zhì)使外泌體成為疾病診斷標(biāo)志 物[6]和天然藥物運(yùn)送載體[7]的研究熱點。其主要優(yōu)點包括[8-10]：1) 外泌體來自身體各個組織，在體液中穩(wěn)定存在，作為疾病標(biāo)志物，易于檢測，并能反映疾病異質(zhì)性及發(fā)生發(fā)展；2) 外泌體起源于自身細(xì)胞，作為藥物載體，免疫原性低、穩(wěn)定，甚至能穿過血腦屏障；3) 在體外，由于蛋白活性及RNA穩(wěn)定性都會受到外界因素影響，因此，外泌體能裝載細(xì)胞內(nèi)源藥物的特點，使得其作為藥物運(yùn)送載體還具有保護(hù)藥物活性及穩(wěn)定性的優(yōu)勢。目前，外泌體已被用于多種藥物的遞送載體，包括小分子、蛋白質(zhì)和核酸[11-16]，顯示較好的治療效果[17-18]。然而，在自然發(fā)生(Biogenesis) 條件下，外泌體對胞內(nèi)藥物的裝載量有限，尚難以推廣應(yīng)用[19]。

外泌體對藥物的裝載方式主要包括兩種，即外源貨物裝載和內(nèi)源貨物裝載[8]。其中，外源貨物裝載主要是通過電轉(zhuǎn)、超聲、凍融、擠出及轉(zhuǎn)染等方法使外源藥物載入外泌體中；內(nèi)源貨物裝載主要是通過外泌體的生物起源使細(xì)胞內(nèi)的藥物裝載到外泌體中。為了提高外泌體對藥物的裝載量，已有研究通過外泌體的生物起源成功實現(xiàn)了內(nèi)源藥物在外泌體中的有效裝載[16, 20]。但更高效的藥物裝載，需要更清楚地了解外泌體對貨物的包裝機(jī)理，從而調(diào)控貨物的分選。因此，如何使細(xì)胞內(nèi)的貨物能更好地富集到外泌體仍然是一個挑戰(zhàn)。

基于外泌體膜起源于細(xì)胞質(zhì)膜，并且會選擇性分選含有某些特定物質(zhì)膜的特點[21]，在前期工作中，我們針對長鏈RNA藥物難以高效遞送的難題，發(fā)展了一種基于外泌體的新型光控納米遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用膜定位元件、光控元件以及外泌體的生物起源，通過microRNA-21治療劑(miR-21海綿) 在細(xì)胞膜的高效富集、光控釋放，實現(xiàn)了miR-21海綿的內(nèi)源高效裝載和對白血病細(xì)胞的靶向遞送，為腫瘤個體化基因診療提供了新的途徑[22]。本研究則聚焦于蛋白類貨物在外泌體中的高效裝載，其研究設(shè)想是，以紅色熒光蛋白mCherry作為模擬裝載貨物，通過在外泌體供體細(xì)胞中融合表達(dá)mCherry與膜定位元件，探討不同膜定位元件對mCherry在外泌體中裝載量的影響，進(jìn)而為外泌體高效遞送蛋白類藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Lipofectamin3000、蛋白預(yù)染marker、4 μm乳膠珠及細(xì)胞培養(yǎng)瓶購于Invitrogen公司。DMEM、胎牛血清(FBS) 及Opti-MEM medium購于GIBCO公司。RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒及ECL顯色液購于碧云天生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶購于NEB公司。感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。超濾管和聚偏二氟乙烯(PVDF) 薄膜均購自Millipore公司。抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。膠回收試劑盒購于美國Omega公司。PCR引物合成及DNA測序由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及慢病毒包裝

為了構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒載體，首先將慢病毒載體PLVX用Ⅰ和Ⅰ酶進(jìn)行雙酶切，其酶切后的產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。Palm、CAAX和PB三個膜定位序列則設(shè)計到PCR引物上，通過PCR擴(kuò)增與mCherry進(jìn)行連接。CD63與mCherry通過RⅠ的酶切位點進(jìn)行連接。上述連接后的產(chǎn)物與PLVX載體通過Ⅰ和Ⅰ位點進(jìn)行連接。

上述表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建好后，先將293T細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度為60%–70%時，參照Lipofectamin 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書將目的質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及VSVG以3︰1︰ 1︰1共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，1 000 r/min離心10 min收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清。收集的病毒液分裝至EP管中，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 慢病毒浸染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

將293T細(xì)胞在含10%胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素) 的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度為50%時，加入一定量的病毒液及4 μg/mL的聚凝胺 (Polybrene) 浸染細(xì)胞。24 h后用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基，48 h后用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測。待觀察到細(xì)胞有熒光時，加入含有嘌呤霉素(4 μg/mL) 抗生素的新鮮培養(yǎng)基對穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體的分離

篩選得到上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后，對其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長到60%–70%的匯度后，把培養(yǎng)基換成含有10%外泌體去除FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并于4 ℃、500×離心5 min，以去除其中殘存的細(xì)胞。然后，4 ℃、2 000×離心10 min，以去除上清中殘存的細(xì)胞碎片，10 000×再次離心30 min可得到微囊泡體。最后，將上清于100 000×下離心120 min，即可得到外泌體沉淀。棄去上清，用PBS清洗沉淀后再次離心，即可得到較為純凈的外泌體。

1.2.4 外泌體的形態(tài)觀察

首先，把10 μL一定濃度的外泌體滴加到300目銅網(wǎng)上，室溫吸附5 min，濾紙吸除多余的液體。然后，滴加10 μL 4%的醋酸雙氧鈾，室溫染色1 min，晾干。最后，通過透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM) 對其進(jìn)行成像分析。

1.2.5 外泌體的熒光分析

首先，把10 μL外泌體(或微囊泡體) 分別加入5 μL的乳膠珠(4 μm) 中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育15 min。然后，用PBS稀釋至500 μL，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min。隨后，通過加入500 μL含100 mmol/L甘氨酸和2% BSA的PBS終止反應(yīng)，并用1%的BSA洗滌結(jié)合了外泌體的珠子3次。用400 μL PBS重懸后，即可用流式細(xì)胞分析儀對其進(jìn)行熒光檢測。

1.2.6 外泌體的蛋白免疫印跡分析(Western blotting，WB)

通過離心收集外泌體(或微囊泡體) 沉淀后，加入一定量的RIPA裂解液提取總蛋白，并根據(jù)BCA試劑盒說明書對提取的總蛋白進(jìn)行定量檢測。隨后，向樣品中加入上樣緩沖液，開水煮沸5 min使蛋白充分變性。蛋白變性后，將 其加到12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離(200 V)。待電泳分離后，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。然后，將PVDF膜放在5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h，并依次加入特異性的一抗及酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育。最后，加入ECL發(fā)光液，并用凝膠成像分析系統(tǒng)對蛋白進(jìn)行成像分析。

1.2.7 胞內(nèi)體及外泌體的成像分析

構(gòu)建好表達(dá)不同mCherry融合蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后，將其培養(yǎng)到玻底小皿中。待其長到一定密度后，即可通過結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(Structure light illumination microscope, SIM)對細(xì)胞中的mCherry進(jìn)行成像分析。外泌體則直接滴加到載玻片上，將其進(jìn)行封片后，即可用SIM顯微鏡進(jìn)行成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜定位融合蛋白mCherry的設(shè)計與表征

為了使mCherry固定到細(xì)胞質(zhì)膜上，3種膜定位肽和1種跨膜蛋白被用來與其融合表達(dá)，分別為PB、CAAX、Palm及CD63蛋白。四種膜結(jié)合元件與膜的相互作用原理如圖1所示。其中，PB和CAAX融合在了mCherry的C端，Palm和CD63融合在了mCherry的N端，具體構(gòu)建如圖2A所示。表達(dá)融合蛋白的各基因片段構(gòu)建好后，將其連接到慢病毒載體PLVX上。然后，通過慢病毒浸染的方法構(gòu)建相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。雖然，融合膜定位元件后的mCherry可以固定到細(xì)胞膜上，但4種融合蛋白與膜的結(jié)合原理都不相同。因此，不同的mCherry融合蛋白在細(xì)胞中的分布也會不同，其成像結(jié)果如圖2B所示。從圖中的結(jié)果可以看到，沒有融合膜定位元件的mCherry分布于整個細(xì)胞質(zhì)中，融合PB和CAAX后的mCherry主要被固定到了細(xì)胞質(zhì)膜上，而與CD63和Palm序列融合后的mCherry在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)都有定位。

圖1 四種膜定位元件與細(xì)胞膜相互作用原理[23-26]

圖2 mCherry與不同膜定位元件融合表達(dá)設(shè)計與實驗結(jié)果(A：用于表達(dá)融合蛋白mCherry的質(zhì)粒示意圖；B：表達(dá)不同mCherry融合蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的熒光成像)

2.2 外泌體的表征

通過對5種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的擴(kuò)大培養(yǎng)，采用差速離心法分別提取了相應(yīng)細(xì)胞所分泌的外泌體，即所設(shè)計的工程化外泌體。接下來WB、TEM和SIM對提取物進(jìn)行了外泌體性質(zhì)表征。WB分析表明，5種細(xì)胞中只有過表達(dá)CD63的細(xì)胞才有相應(yīng)的條帶，而5種細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體均含有CD63，說明外泌體具有富集CD63的功能(圖3A)；在電鏡下，提取物呈現(xiàn)茶托狀，大小在150 nm左右(圖3B)。

SIM成像進(jìn)一步對所收集的外泌體進(jìn)行了分析，以驗證其中的確有mCherry的紅色熒光，結(jié)果如圖3C所示，沒有表達(dá)mCherry細(xì)胞來源的外泌體中幾乎沒有紅色熒光，而表達(dá)CD63-mCherry細(xì)胞來源的外泌體中有大量的紅色熒光，說明mCherry被外泌體成功包裝。

2.3 外泌體中mCherry裝載量的分析

由于所選4種膜定位元件的細(xì)胞膜結(jié)合原理各不相同，它們分別與mCherry融合后可能導(dǎo)致不同的分選效率，因此，提取4種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系所分泌的外泌體后，對其中的mCherry含量進(jìn)行了WB分析比較。如圖4A所示，除了無膜定位元件的mCherry對照組外，其余4種都含有mCherry，其中CD63組含量最高，Palm組次之，CAAX和PB組中mCherry的量很少。圖4A中mCherry融合物具有不同的遷移率，這是因為融合了不同分子量的膜定位蛋白所致。流式細(xì)胞分析表明(圖4B)，CAAX、PB、Palm和CD63對應(yīng)外泌體中mCherry的陽性率分別為8.9%、7.3%、23.2%和56.7%，而無膜定位元件的對照組中mCherry陽性率只有4%。上述結(jié)果表明，4種膜定位序列都具有將靶蛋白定位在細(xì)胞膜并分選入外泌體的能力，以CD63的效果最為明顯。

2.4 微囊泡體中mCherry裝載量的分析

微囊泡體中mCherry的分析結(jié)果如圖5所示。其中，Western blotting結(jié)果表明，除了無膜定位元件的mCherry外，其余幾種都含有mCherry。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，CAAX、PB、Palm及CD63對應(yīng)微囊泡體中mCherry的陽性率分別為12.0%、10.8%、17.7%和20.6%。因此，在微囊泡體中，4種mCherry融合蛋白在其中的富集效果差別不大，且都不如外泌體中CD63-mCherry的富集效果好。

圖3 外泌體的表征(A：外泌體中CD63和β-actin蛋白的WB分析；B：外泌體的TEM成像；C：外泌體的SIM超分辨顯微成像)

圖4 外泌體中mCherry的定量分析

2.5 mCherry在細(xì)胞中的定位分析

不同mCherry融合蛋白在外泌體中存在裝載量差異，這可能與外泌體的生物起源有關(guān)。如圖6A所示，外泌體是通過細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)吞、多囊泡體形成以及多囊泡體與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放所形成。為了分析分選量差異的原因，SIM超分辨成像技術(shù)對4種細(xì)胞中mCherry的定位進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同的膜定位元件會使mCherry被定位到細(xì)胞的不同膜結(jié)構(gòu)(圖6B)。其中，CAAX和PB序列能使mCherry定位到細(xì)胞質(zhì)膜上，但幾乎不定位在內(nèi)囊泡膜上，而Palm和CD63會使mCherry同時靶向到細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)囊泡膜(后者為細(xì)胞中紅色聚集亮斑)，CD63的這種功能最為明顯。

圖5 微囊泡體中mCherry的定量分析

3 討論

針對外泌體載藥效率低的缺點，通過在蛋白一端融合表達(dá)膜定位元件使其富集到細(xì)胞質(zhì)膜上的方法已有不少研究，例如，通過CD9[27]、CD63[28]、Lamp2a[29]和Palm[25]等的膜定位作用，已實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)源RNA和蛋白在外泌體中的富集。但由于外泌體中蛋白的分選機(jī)理也還未完全被了解，哪一種膜定位序列能更好提高蛋白在外泌體的裝載效率也未見研究報道，因此，本文選擇了幾種具有不同細(xì)胞膜結(jié)合原理的元件對其進(jìn)行分析，包括CAAX、PB和Palm三個膜定位肽，以及CD63跨膜蛋白。

Western blotting和流式細(xì)胞技術(shù)對5種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系來源外泌體中mCherry的半定量分析表明，4種膜定位元件都能提高mCherry在外泌體中的裝載量，但效率各不相同。如圖1所示，PB攜帶正電荷，與細(xì)胞質(zhì)膜上帶負(fù)電的磷脂酰肌醇靜電作用而固定到膜上[23]。CAAX是通過異戊二烯基團(tuán)法尼基與細(xì)胞質(zhì)膜上磷脂雙分子層的相互作用而與膜結(jié)合[24]。Palm則通過半胱氨酸與脂肪酸棕櫚酸之間的硫酯鍵作用與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合[25]。CD63是一個富集在外泌體中的四跨膜蛋白[26]。所以，上述4種膜定位元件可以使mCherry結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜的不同成分上，而外泌體對細(xì)胞質(zhì)膜上不同成分的選擇性分選富集，就會導(dǎo)致融合有不同膜定位元件的mCherry隨與之相互作用的成分以不同的量分選到外泌體中。對此，細(xì)胞中mCherry的SIM成像分析也證明了4種膜定位元件使mCherry以不同量定位在了外泌體起源的內(nèi)囊泡上。此外，微囊泡體中4種mCherry融合蛋白的裝載量分析結(jié)果顯示，4種融合蛋白在微囊泡體中的富集效果相似。其中，CAAX和PB與外泌體中的幾乎相同，但CD63和Palm都沒有外泌體中的效果好。雖然微囊泡體的膜是直接起源于細(xì)胞質(zhì)膜，但mCherry在細(xì)胞質(zhì)膜上的富集并沒有使其在微囊泡體中產(chǎn)生大的富集量。該結(jié)果也可以說明外泌體會對細(xì)胞質(zhì)膜上的成分進(jìn)行選擇性富集。而且，通過在細(xì)胞膜上富集的方法，外泌體比微囊泡體能更好地分選細(xì)胞內(nèi)源蛋白。

圖6 mCherry在細(xì)胞中的定位分析(A：外泌體的生物發(fā)生起源示意圖；B：mCherry融合不同的膜定位元件后在細(xì)胞中的SIM成像)

以mCherry作為模擬蛋白，雖然CD63蛋白和Palm都很好地提高了mCherry在外泌體中的裝載量，但本研究只選擇了部分膜定位元件進(jìn)行分析，而更好地提高蛋白在外泌體中的分選量，還需基于外泌體對蛋白的分選機(jī)理，對更多的膜定位元件進(jìn)行分析。而且，裝載藥物時該裝載效率能否使之在細(xì)胞中達(dá)到治療效果，以及該工程化外泌體所裝載的藥物是否具有活性都需驗證。此外，由于外泌體對蛋白的分選具有復(fù)雜的機(jī)理，而不只是單一因素決定，因此不同膜定位元件是否對所有蛋白都具有相似的效果也需要進(jìn)一步驗證。

綜上，本研究不僅證明了不同的膜定位元件可以使mCherry在外泌體中產(chǎn)生裝載量的差異，還初步分析了其產(chǎn)生差異的可能原因，確定了CD63是其中能使靶蛋白更好分選入外泌體中的膜定位元件。

致謝：感謝生物成像中心(IBP-CAS)，特別是李碩果，張龍龍等人對SIM、TEM工作的技術(shù)支持。

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Construction of engineered exosomes with high loading efficiency of cellular endogenous proteins

Lin Huang1,2*, Dianbing Wang2*, Ning Gu1, and Xian-en Zhang1,2,3

1 School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096, Jiangsu, China 2 National Laboratory of Biomacromolecules, CAS center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Exosomes have many advantages as natural drug delivery carriers, but their application is limited by the inefficient loading of intracellular drugs (such as proteins and nucleic acids). In this study, mCherry, a red fluorescent protein, was used as the endogenous cargo target. Through gene modification of donor cells and fusion expression of membrane localization elements (PB, CAAX, Palm and CD63), mCherry was specifically sorted into exosomes through biogenesis. Results show that CD63 had the highest sorting efficiency, followed by Palm. PB and CAAX led enrichment of mCherry on the plasma membrane, but not in exosomes. The approach provides an alternative to facilitate packaging of cargo by exosomes and thus to increase the efficient delivery of endogenous protein drugs.

exosome, drug delivery carrier, endogenous protein, membrane localization element, loading efficiency

April 6, 2019;

May 20, 2019

Supported by: the Major Program of National Natural Science Foundation of China (No. 21890743), the National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFA0205503).

Xian-en Zhang. Tel: +86-10-64888148; E-mail: zhangxe@ibp.ac.cn

*These authors contributed equally to this study.

國家自然科學(xué)基金重大項目 (No. 21890743)，國家重點研發(fā)項目 (No. 2017YFA0205503) 資助。

2019-06-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190617.1050.004.html

黃琳, 王殿冰, 顧寧, 等. 高效裝載細(xì)胞內(nèi)源蛋白工程化外泌體的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(8): 1537–1545.Huang L, Wang DB, Gu N, et al. Construction of engineered exosomes with high loading efficiency of cellular endogenous proteins. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1537–1545.

(本文責(zé)編 郝麗芳)