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      促紅細(xì)胞生成素對大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

      2019-09-04 09:15:20趙德福張輝楊文海
      中國老年學(xué)雜志 2019年17期
      關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)腦缺血低劑量

      趙德福 張輝 楊文海

      (錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州 121000)

      我國腦血管病的發(fā)病率和死亡率都位居第一位,而腦血管病患者中約70%為缺血性腦血管病,后者主要的一個病理損傷就是缺血再灌注損傷〔1〕。在缺血再灌注損傷這一病理過程中,有多種發(fā)病機(jī)制參與其中,如細(xì)胞外基質(zhì)的破壞、鈣超載、炎癥反應(yīng)〔2〕等,這其中起到重要作用的是細(xì)胞外基質(zhì)的破壞〔3〕。據(jù)報道有細(xì)胞外基質(zhì)破壞作用的物質(zhì)之一就是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9〔4〕,而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1能起到修復(fù)組織損傷的功能〔5〕。本實驗,擬在腦缺血再灌注模型大鼠中以促紅細(xì)胞生成素(EPO)為干預(yù)手段,以TGF-β1和MMP-9為實驗觀測指標(biāo),探索EPO在腦缺血再灌注模型大鼠細(xì)胞外基質(zhì)損傷與修復(fù)過程中的保護(hù)作用。

      1 材料與方法

      1.1儀器 160x連續(xù)變倍體式顯微鏡(桂林儀器廠);CIAS-1000圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司);LEICA-RM2135石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司)。

      1.2試藥 EPO(成都地奧制藥廠);TGF-β1一抗及MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

      1.3動物 由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,90只健康SD大鼠,雄性,大鼠體重240~260 g,許可證號:SCXK(遼)2003-2007。

      1.4大鼠分組與給藥 大鼠被隨機(jī)分為5組(每組18只):假手術(shù)組、缺血再灌注組和EPO低、中、高劑量(1 000 U/kg、3 000 U/kg、5 000 U/kg,中劑量EPO取人臨床應(yīng)用劑量標(biāo)準(zhǔn))組,術(shù)前EPO 3個劑量組分別給予規(guī)定劑量的EPO腹腔注射連續(xù)3 d,每天1次,在相同條件下,缺血再灌注組和假手術(shù)組分別給予腹腔注射等量的生理鹽水。

      1.5模型制備方法 大鼠大腦中動脈閉塞模型采用線栓法〔6〕。所有大鼠術(shù)前禁食禁水6 h,腹腔注射水合氯醛(濃度為3 ml/kg)麻醉,固定于手術(shù)臺,頸中略偏左切開皮膚,找到頸總動脈并手術(shù)分離,從其近心端用頸動脈夾夾住,手術(shù)剪于頸總動脈剪一切口,動脈插管插入,順動脈導(dǎo)管插入已處理的魚線,經(jīng)頸總動脈、頸內(nèi)動脈到大腦中動脈,以充分阻斷大腦中動脈的血流,然后插管撤出,皮膚縫合,魚線于血流中斷2 h撤出,血流再灌注,持續(xù)時間12 h,判定缺血再灌注模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)功能評分〔6〕為1~3分。

      1.62,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察各組大鼠腦梗死體積 上述處理后,每組抽取大鼠6只,斷頭處死后留取腦組織,并將腦組織置于溫度為-20℃的冰箱中持續(xù)20 min,沿腦組織的冠狀面將其制成厚度為0.2 mm的腦片,將其浸入到濃度為2% 的TTC溶液,溫度為37℃的水浴持續(xù)30 min。將采集來的圖像,應(yīng)用圖像處理軟件做相應(yīng)處理,腦梗死體積計算方式采用文獻(xiàn)〔7〕的方法計算。

      1.7免疫組化法觀察TGF-β1、MMP-9的表達(dá) 每組取6只大鼠,烏拉坦(5 ml/kg)麻醉,斷頭后分離海馬組織,多聚甲醛(濃度4%)固定,制備厚度約5 μm的切片,切片予脫蠟、洗滌,過氧化氫(H2O2,濃度3%)處理,用濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,每次5 min,滴加TGF-β1或MMP-9一抗,孵育過夜(溫度控制4℃),PBS洗滌3次,每次5 min,予滴加二抗,37℃孵育30 min,室溫孵育10 min,PBS洗滌3次,每次5 min,滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,干燥,鏡下觀察。

      1.8Western印跡檢測TGF-β1、MMP-9蛋白的表達(dá) 取剩余6只大鼠,麻醉斷頭取海馬組織,剪碎,加入裂解液,離心機(jī)離心,留取上清液,制備組織蛋白樣品;測定蛋白含量;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃度10%);將組織蛋白轉(zhuǎn)移至正電荷尼龍膜上;封閉雜交;試劑盒顯色;分別分析TGF-β1蛋白和MMP-9蛋白的表達(dá)量。

      1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

      2 結(jié) 果

      2.1神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組神經(jīng)功能正常;缺血再灌注組與假手術(shù)組相比,出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙,評分升高(P<0.01);EPO 3個劑量組神經(jīng)功能與缺血再灌注組相比,評分明顯降低(P<0.01);與EPO低劑量組相比,EPO中、高劑量組神經(jīng)功能障礙程度顯著減輕,評分顯著下降(P<0.05);而EPO中劑量組神經(jīng)功能與EPO高劑量組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

      2.2TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組腦組織顏色紅潤,無梗死;缺血再灌注組和EPO 3個劑量組梗死區(qū)腦組織腫脹,顏色蒼白,進(jìn)一步計算腦梗死體積,發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組顯著高于EPO 3個劑量組(P<0.01);與EPO低劑量組比較,EPO中、高劑量組腦梗死體積進(jìn)一步減小(P<0.05);但EPO中劑量組與EPO高劑量組間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

      表1 各組神經(jīng)功能學(xué)評分及腦梗死體積比較

      與假手術(shù)組比較:1)P<0.01;與缺血再灌注組比較:2)P<0.01;與EPO低劑量組比較:3)P<0.05;下表同

      2.3免疫組化染色結(jié)果 觀察大鼠海馬組織CA1區(qū),正常時MMP-9和TGF-β1主要存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),蛋白表達(dá)量少,被外界刺激因素激活后TGF-β1迅速從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。TGF-β1、MMP-9在假手術(shù)組細(xì)胞內(nèi)極少表達(dá)。缺血再灌注組胞核內(nèi)TGF-β1及胞質(zhì)內(nèi)MMP-9較假手術(shù)組表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與缺血再灌注組相比,EPO 3個劑量組胞核內(nèi)TGF-β1表達(dá)明顯增多,胞質(zhì)內(nèi)MMP-9的表達(dá)明顯減少(P<0.01),且EPO中、高劑量組TGF-β1、MMP-9的變化較EPO低劑量組更明顯(P<0.05)。但EPO中、高劑量組間TGF-β1、MMP-9的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見圖1,表2。

      圖1 各組TGF-β1、MMP-9免疫組化染色結(jié)果(×400)

      表2 免疫組化檢測各組大鼠TGF-β1 和MMP-9的表達(dá)

      2.4Western印跡法檢測結(jié)果 TGF-β1和MMP-9蛋白在假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)幾乎不表達(dá)。與假手術(shù)組相比,缺血再灌注組TGF-β1、MMP-9的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與缺血再灌注組相比,EPO 3個劑量組TGF-β1表達(dá)明顯增多,MPP-9的表達(dá)明顯降低(P<0.01),與EPO低劑量組相比,EPO中、高劑量組TGF-β1和MPP-9表達(dá)量變化更加顯著(P<0.05);EPO中、高劑量組間TGF-β1和MMP-9的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見表3。

      表3 Western印跡檢測各組TGF-β1 和MMP-9蛋白表達(dá)

      3 討 論

      腦缺血再灌注損傷是腦梗死發(fā)病及治療過程中的一個非常重要的病理生理過程〔8〕。腦梗死后缺血再灌注損傷的病理機(jī)制多種多樣,細(xì)胞外基質(zhì)的破壞在此過程中扮演了重要角色。

      降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要物質(zhì)之一是MMP-9,MMP-9在正常腦組織細(xì)胞很少表達(dá),當(dāng)腦缺血再灌注時,腦組織細(xì)胞內(nèi)MMP-9〔9〕表達(dá)明顯增多,MMP-9將會降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞基底膜的成分,結(jié)果是腦內(nèi)血管通透性增加,腦血腦屏障受到破壞。與MMP-9破壞細(xì)胞外基質(zhì)功能相對應(yīng)的是,TGF-β1具有組織損傷修復(fù)的功能〔10〕。TGF-β1的存在曾被看作是神經(jīng)元存活的重要標(biāo)志,其具有多種生理功能,包括促進(jìn)細(xì)胞生長分化、抑制炎癥及促進(jìn)組織修復(fù)等。TGF-β1在腦缺血過程中的作用近年來被逐漸重視〔11〕,腦損傷時TGF-β1的表達(dá)對腦損傷的保護(hù)和修復(fù)極其關(guān)鍵〔12〕。

      EPO是臨床中各種貧血治療中的一線用藥。其在神經(jīng)保護(hù)方面的作用是近年來國內(nèi)外研究的熱點,結(jié)果不一,Jantzie等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn) EPO對腦損傷具有修復(fù)作用,也有研究發(fā)現(xiàn)EPO具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)功〔14〕,但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前尚不十分明確。

      本實驗結(jié)果顯示,缺血再灌注組在缺血再灌注12 h后較假手術(shù)組神經(jīng)功能障礙明顯,腦梗死體積增大,海馬組織TGF-β1及MMP-9的表達(dá)升高;EPO各劑量組與缺血再灌注組比較,大鼠神經(jīng)功能缺損減輕,腦梗死體積減小,海馬區(qū)TGF-β1的表達(dá)增加,MMP-9的表達(dá)下降,這一實驗結(jié)果提示,大鼠腦缺血再灌注損傷的過程中MMP-9發(fā)揮了重要作用,而 在這一過程中,TGF-β1對腦損害起到保護(hù)功能。實驗還表明,腦缺血再灌注過程中,EPO可以使MMP-9的表達(dá)減少,TGF-β1的表達(dá)增多,起到神經(jīng)保護(hù)作用。EPO的劑量不同,其發(fā)揮作用的程度也不同,與EPO低劑量組相比,EPO中、高劑量組效果更明顯,EPO中、高劑量組間效果無明顯差異。在效果相同的情況下,EPO作為促進(jìn)紅細(xì)胞生成藥物,高劑量組其副作用可能也會較大,因此,中劑量EPO其發(fā)揮腦保護(hù)作用可能最佳。

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