HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地杜仲雄花茶中3種活性成分含量

魏媛媛 李偉業(yè) 溫曉

摘要 [目的]建立高效液相色譜法多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷3種活性成分含量。[方法]采用Thermal Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.3%磷酸溶液梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫26 ℃；多波長(zhǎng)檢測(cè)206、238、327 nm。[結(jié)果]桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷均在測(cè)定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 1）。同一時(shí)期內(nèi)采集，不同產(chǎn)地的杜仲雄花茶因環(huán)境的影響，桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷的含量差異較大。[結(jié)論]所建方法簡(jiǎn)便快捷、重現(xiàn)性好，可用于杜仲雄花茶桃葉珊瑚苷、綠原酸及京尼平苷的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 杜仲雄花茶；桃葉珊瑚苷；綠原酸；京尼平苷；高效液相色譜法

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）08-0192-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.050

Abstract [Objective] The research aimed to establish a HPLC method for simultaneous determination of aucubin，chlorogenic acid and geniposide in Eucommia ulmoides male flower tea from different habitats at multiple wavelengths.[Method]Thermal Hypersil BDS C18 （ 4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used for gradient elution with acetonitrile-0.3% phosphoric acid solution.The flow rate was 1.0 mL/min；column temperature was 26 ℃；multiwavelength detection：206 nm，238 nm，327 nm.[Result]Aucubin， chlorogenic acid and geniposide showed good linear relationships （r≥0.999 1） in the determination range.The contents of aucubin， chlorogenic acid and geniposide in Eucommia ulmoides male flower tea collected in the same period vary greatly due to environmental influences. [Conclusion]The established method is simple， rapid and reproducible， and can be used for the determination of aucubin， chlorogenic acid and geniposide in Eucommia ulmoides male flower tea.

Key words Eucommia ulmoides male flower tea；Aucubin；Chlorogenic acid；Geniposide；HPLC

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）屬于杜仲科（Eucommiaceae）杜仲屬（Eucommia）喬木植物。近幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究表明，杜仲富含次生代謝產(chǎn)物，主要有總黃酮、木質(zhì)素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類、三萜、甾類等[1-4]。目前，在杜仲全身中分離出的環(huán)稀醚萜類化合物有近20多種，包括京尼平苷、京尼平、京尼平苦酸、桃葉珊瑚苷、車葉草苷等[5]。環(huán)烯醚萜類化合物具有抗炎、抗腫瘤、利膽、保肝、通便及治療風(fēng)濕等功能，綠原酸具有抗菌、抑制突變、保護(hù)心血管等作用；苯丙素類化合物，包括香豆素、綠原酸、綠原酸甲酷、咖啡酸乙酷、松柏苷、松柏酸、丁香苷、間輕基苯丙酸和寇布拉苦等[6-11]。

目前，市場(chǎng)出售的杜仲雄花茶遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到杜仲雄花本身具有的價(jià)值。產(chǎn)地差異是造成杜仲雄花茶品質(zhì)差異的原因之一。杜仲雄花經(jīng)過(guò)殺青、烘干、復(fù)火工序等加工成杜仲雄花茶，在此過(guò)程中，杜仲雄花中富含的環(huán)烯醚萜等活性成分易發(fā)生水解等破壞，同樣造成杜仲雄花茶外觀品質(zhì)變差，營(yíng)養(yǎng)成分流失。筆者建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定3種活性成分，完善了杜仲雄花的檢測(cè)方法，節(jié)省了大量時(shí)間與工序；同時(shí)對(duì)比了不同產(chǎn)地的杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷成分含量，為杜仲雄花的加工方式和消費(fèi)者提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器 Thermo Evolution 220型紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific-Shanghai）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；XD-5200DT型超聲波清洗儀（南京先歐儀器制造有限公司）；Hei-VAP value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AEL-40SM型半微量天平（Shimadzu 1991）。水浴鍋（HWS-24）；烘箱（WGLL-230BE，天津市泰斯特儀器有限公司）；粉碎機(jī)。

1.2 試驗(yàn)材料 桃葉珊瑚苷、京尼平苷、綠原酸對(duì)照品來(lái)自中國(guó)生物制品鑒定院；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸溶液、超純水、分析乙醇等均購(gòu)為分析純。原料編號(hào)和產(chǎn)地見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件。Thermal Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表2中的規(guī)定梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min；柱溫26 ℃；多波長(zhǎng)檢測(cè)：206、238、327 nm；檢測(cè)時(shí)間為25 min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取桃葉珊瑚苷對(duì)照品京尼平苷8.02 mg、綠原酸對(duì)照品7.88 mg、京尼平苷對(duì)照品4.33 mg，置同一5 mL棕色容量瓶中，超純水定容，搖勻，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備。取杜仲雄花茶樣品，研細(xì)，過(guò)四號(hào)篩，取約0.8 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液30 mL，密塞，超聲處理40 min，過(guò)濾得濾液，向裝有濾渣的錐形瓶中再次加入甲醇溶液30 mL，同樣處理方法得濾液并合并2次濾液濃縮，以超純水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為供試品溶液。

1.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各15 μL，在“1.3.1”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.3.5 線性關(guān)系考察。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL定容至10 mL容量瓶中，再經(jīng)0.45 μm微孔膜濾過(guò)，依次進(jìn)樣20 μL測(cè)定其峰面積。分別以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.3.6 精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取含桃葉珊瑚苷8.02 μg/mL、綠原酸7.80 μg/mL、京尼平苷4.33 μg/mL的混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定并計(jì)算RSD。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取編號(hào)③產(chǎn)地的杜仲雄花茶，稱取杜仲雄花茶粗粉各6份，每份約0.8 g，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算RSD。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)。取編號(hào)③產(chǎn)地杜仲雄花茶粉碎成粗粉，分別取粗粉0.4 g，各5份，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD。

1.3.9 回收率試驗(yàn)。取編號(hào)③產(chǎn)地杜仲雄花茶粗粉約0.4 g置于25 mL錐形瓶，各6份，每份分別加入含桃葉珊瑚苷8.02 μg/mL、綠原酸7.88 μg/mL、京尼平苷4.33 μg/mL的混合對(duì)照品溶液適量，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。

1.3.10 樣品測(cè)定。依照“1.3.3”供試品制備方法及“1.3.1”色譜條件測(cè)定各個(gè)產(chǎn)地的桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷3種活性成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在不同對(duì)照品相同的出峰時(shí)間（t1=6.7 min，t2=18.9min，t3=21.5min）都有一個(gè)峰出現(xiàn)，說(shuō)明該峰即為樣品中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷的峰，且該條件下樣品中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷的峰與相鄰峰有一定的分離度，說(shuō)明此條件適合該樣品測(cè)定桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷。

2.1.2 線性關(guān)系考察。分別以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程?；貧w方程與線性范圍如表3所示，結(jié)果表明，桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷對(duì)照品濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按照“1.3.6”操作，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為1.58%、0.82%、1.35%，表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.3.7”操作，計(jì)算得出產(chǎn)地③杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為1.33%、0.78%、1.24%，表明編號(hào)③產(chǎn)地杜仲雄花茶溶液中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.3.8”操作，取編號(hào)③產(chǎn)地杜仲雄花茶粉測(cè)定，計(jì)算雄花花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為1.39%、1.60%、1.78%，表明重復(fù)性好。

2.1.6 回收率試驗(yàn)。按照“1.3.9”操作，計(jì)算得出編號(hào)③產(chǎn)地的杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷的平均回收率分別為95.3%、98.1%、96.8%，RSD分別為1.64%、1.51%、1.74%，表明該方法重復(fù)性好，方法可靠。

2.2 樣品測(cè)定 由表4可知，不同產(chǎn)地杜仲雄花茶的桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷含量差異較大，其中編號(hào)⑦即湖北（襄陽(yáng)）的杜仲雄花茶中京尼平苷含量較高，編號(hào)⑧即陜西（略陽(yáng)）的雄花茶中桃葉珊瑚苷和綠原酸含量較高；就湖南產(chǎn)地而言，張家界慈利縣2016年的杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷含量整體高于其他地區(qū)；造成不同活性成分含量的差異不僅與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、土壤情況以及海拔有關(guān)，還與貯存方式有關(guān)。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 根據(jù)桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，選擇C18柱，以乙腈-磷酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，色譜峰分離效果較好。

3.2 柱溫選擇 色譜柱與流動(dòng)相的溫度影響著組分的分離平衡。柱溫26 ℃時(shí)，組分峰的分離度相對(duì)較好，升高溫度，各色譜峰之間已無(wú)明顯差異，因此，選擇柱溫為26 ℃。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 已有文獻(xiàn)同時(shí)測(cè)定3種活性成分采用單波長(zhǎng)或者雙波長(zhǎng)檢測(cè)[12-13]，其中綠原酸未在其最大吸收峰處定量檢測(cè)，而該試驗(yàn)測(cè)量的桃葉珊瑚苷含量相對(duì)較低，若采用雙波長(zhǎng)也未必能被檢測(cè)。所以該試驗(yàn)選擇二極管陣列檢測(cè)器DAD，使所有波長(zhǎng)的光在接收器上同時(shí)被檢測(cè)。桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷分別在206、327、238 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，因此在液相參數(shù)選擇中應(yīng)用多波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

3.4 流動(dòng)相的選擇 杜仲雄花茶成分復(fù)雜，目標(biāo)峰附近的雜質(zhì)峰較多，尤其桃葉珊瑚苷出峰時(shí)間短，易與溶劑峰交疊重合，該試驗(yàn)一方面采用甲醇提取，超純水定容，在提高提取率的同時(shí)，減少了在測(cè)定過(guò)程中溶劑峰的影響；另一方面，調(diào)小流動(dòng)相的極性，最終選擇在0～8 min，乙腈∶0.3%磷酸水=4∶96，綠原酸與京尼平苷出峰時(shí)間20 min左右，選擇乙腈∶0.3%磷酸水=11∶89。在流動(dòng)相中加入少量磷酸可抑制羧基、酚羥基的離解，從而使兩峰的峰形得到改善。因此，最終選擇乙腈-0.3%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫可使3種成分有較好的分離度。

4 結(jié)論

該研究建立了HPLC法多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地杜仲雄花茶中桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷3種活性成分含量。采用Thermal Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.3%磷酸溶液梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫26 ℃；多波長(zhǎng)檢測(cè)：206、238、327 nm。其中湖北（襄陽(yáng)）的杜仲雄花茶中京尼平苷含量相對(duì)較高，陜西（略陽(yáng)）的雄花茶中桃葉珊瑚苷和綠原酸含量相對(duì)較高。

經(jīng)方法學(xué)考察，該試驗(yàn)的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可對(duì)不同產(chǎn)地杜仲雄花茶含量進(jìn)行分析比較，對(duì)比了各產(chǎn)地之間的含量差異，為測(cè)定杜仲雄花茶的活性成分提供了快捷、可行的測(cè)定方法，也為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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