柴芩清熱口服液微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

王丹 裴斯彪 彭賢東 唐志立 郭廷東 潘良平

摘要?目的：建立柴芩清熱口服液微生物限度檢查方法，并對5個(gè)不同批次柴芩清熱口服液微生物限度進(jìn)行適用性試驗(yàn)。方法：根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》制備金黃色葡萄球菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、大腸埃希菌菌液、白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液和銅綠假單胞菌菌液;而后采用氯化鈉胰蛋白胨稀釋液制得1∶10的柴芩清熱口服液供試品溶液;根據(jù)藥典中微生物限度檢查法，一步一步建立方法學(xué)，即進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)和控制菌檢查試驗(yàn)，并重復(fù)3次進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，對柴芩清熱口服液中微生物的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果：1）需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)中：采用薄膜過濾法微生物限度適用性試驗(yàn)研究，柴芩清熱口服液需氧菌的菌株回收率計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的菌株回收率計(jì)數(shù)分別為1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。2）霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)中結(jié)果顯示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分別是0.89和0.89。3）柴芩清熱口服液在常規(guī)法檢測控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果中顯示，每1 g柴芩清熱口服液供試品中可能的菌數(shù)（102

關(guān)鍵詞?柴芩清熱口服液;薄膜過濾法;大腸埃希菌;金黃色葡萄球菌;白色念珠菌;黑曲霉;銅綠假單胞菌;枯草芽孢桿菌;微生物限度;適用性試驗(yàn)

Applicability Test of Microbiological Limit Test Method for Chaiqin Qingre Oral Liquid

Wang Dan1，2， Pei Sibiao2， Peng Xiandong2， Tang Zhili2， Guo Tingdong2， Pan Liangping2

（1 Second Clinical Medical College， North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， China; 2 Department of Pharmacy， Nanchong Central Hospital， Nanchong 637000， China）

Abstract?Objective：To establish a microbiological limit test method of Chaiqin Qingre Oral Liquid and to test the applicability of 5 different batches of Chaiqin Qingre Oral Liquid.Methods：Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Candida albicans， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were prepared according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.Then the sample solution of Chaiqin Qingre oral liquid was prepared by sodium chloride tryptone dilution solution at 1：10.According to the microbial limit test method in Pharmacopoeia， the methodology was established step by step， that is， the applicability test of counting method and the test of control bacteria.The content of microorganism in Chaiqin Qingre oral liquid was detected by repeated verification for 3 times.Results：1）In the count of aerobic bacteria， the applicability test of microbial limit by membrane filtration was carried out.The results showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus， Candida albicans， Bacillus subtilis， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were 1.02， 0.99， 0.84， 0.96， 0.99， respectively.2）The recovery rates of Candida albicans and Aspergillus Niger were 0.89 and 0.89， respectively.3）The results of the applicability test of Chaiqin Qingre oral liquid in the routine method showed that the possible number of bacteria per 1 g of Chaiqin Qingre oral liquid was（102

Key Words?Chaiqin Qingre oral liquid; Membrane filtration method; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Candida albicans; Aspergillus Niger; Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis; Microbial limit; Applicability test

中圖分類號：R286.0文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.009

柴芩清熱口服液我院的院內(nèi)制劑，主要運(yùn)用于上呼吸道感染的治療，患者多出現(xiàn)咳嗽流涕、咽痛鼻塞等癥狀，屬于中醫(yī)學(xué)中“風(fēng)熱感冒”的范疇[1]，柴芩清熱口服液的主要藥物組成有山銀花、薄荷、法半夏、柴胡、連翹、蘆竹根、黃芩、青蒿、荊芥、板藍(lán)根等。制作成口服液的形式，主要是考到到患者服用時(shí)的便利性和便攜性。我國2015版《中華人民共和國藥典》對口服制劑的微生物限度要求為，所檢測樣品中細(xì)菌、霉菌、酵母菌的所有菌數(shù)總和必須低于10 cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌和大腸菌群[2-3]，基于此，本研究就柴芩清熱口服液進(jìn)行微生物限度檢查，采用薄膜過濾法入手對柴芩清熱口服液中白色念球菌、黑曲霉、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的驗(yàn)證回收率進(jìn)行展開研究，而后進(jìn)一步以大腸埃希菌直接檢查法進(jìn)行微生物限度適用性試驗(yàn)研究?，F(xiàn)具體報(bào)道如下。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?蘇凈二級全排風(fēng)生物安全柜（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司，型號BSC-1600IIB2）;全封閉式集菌儀（上海喬躍電子有限公司，型號ZW-2008）;四川隔水式恒溫培養(yǎng)箱（成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司，型號BG-80）;型霉菌培養(yǎng)箱（重慶市松朗電子儀器有限公司，型號JC-250F-I）。

1.2?試劑?MUG營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA-MUG，產(chǎn)品號：CM1517）、胰酪大豆胨培養(yǎng)基（產(chǎn)品號：CC-1411-25）和沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（產(chǎn)品號：HB0110-6）購買于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。改良馬丁培養(yǎng)基（青島海博生物有限公司，產(chǎn)品號：HB5222）;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（產(chǎn)品號：HB0108-4）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（產(chǎn)品號：PX010224）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)品號：HB0109-7）和氯化鈉胰蛋白胨稀釋液（產(chǎn)品號：PX011018）購于北京譜析科技有限公司。

1.3?菌種?金黃色葡萄球菌菌株（產(chǎn)品號：PX50254）、枯草芽孢桿菌菌株（產(chǎn)品號：PX50222）、大腸埃希菌菌株[產(chǎn)品號：CM-CC（B）44102]、白色念珠菌菌株（產(chǎn)品號：PX50240）和黑曲霉菌株（產(chǎn)品號：PX50241）均購買于北京譜析科技有限公司;銅綠假單胞菌菌株[產(chǎn)品號：CMCC（B）10104]購買于中國食品藥品檢定研究院。

1.4?分析樣品?選擇5個(gè)不同批次的柴芩清熱口服液（川北醫(yī)學(xué)院附屬南充市中心醫(yī)院，批準(zhǔn)文號：川藥制字Z20080285）。

2?方法

2.1?菌液的制備?1）所有菌液的制備均嚴(yán)格按照2015年版《中華人民共和國藥典》一部附錄重的具體要求進(jìn)行操作[4-6]，其中金黃色葡萄球菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、大腸埃希菌菌液和銅綠假單胞菌菌液的制作均是，分別將金黃色葡萄球菌菌株、枯草芽孢桿菌菌株、大腸埃希菌菌株和銅綠假單胞菌菌株接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過24 h培養(yǎng)箱（30～35 ℃）的培養(yǎng)后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用0.9無菌氯化鈉溶液將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗(yàn)證中中，在此基礎(chǔ)上制成菌懸液含有的菌落數(shù)均<100 cfu/mL。2）白色念珠菌菌液的制備是將白色念珠菌株接種到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過2～3 d霉菌培養(yǎng)箱（20～25 ℃）的培養(yǎng)后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用0.9無菌氯化鈉溶液將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗(yàn)證中中，在此基礎(chǔ)上制成菌懸液含有的菌落數(shù)均<100 cfu/mL。3）黑曲霉菌液的制備是將黑曲霉菌菌株接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，經(jīng)過5～7 d霉菌培養(yǎng)箱（20～25 ℃）的培養(yǎng)后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用（0.9無菌氯化鈉溶液+0.05（v/v）吐溫80）將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗(yàn)證中中，在此基礎(chǔ)上制成菌懸液含有的菌落數(shù)均<100 cfu/mL。

2.2?供試品溶液的制備?首先將氯化鈉胰蛋白胨稀釋液調(diào)到pH值7.0時(shí)，精密量取柴芩清熱口服液10 mL，加入氯化鈉胰蛋白胨稀釋液至100 mL并劇烈振搖，重復(fù)混合均勻制得1∶10的柴芩清熱口服液供試品溶液。

2.3?柴芩清熱口服液計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1?需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)?采用薄膜過濾法將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經(jīng)滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應(yīng)的需氧菌試驗(yàn)菌液，嚴(yán)格根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》使其終濃度的菌落數(shù)<100 cfu/mL，經(jīng)過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL無菌氯化鈉-蛋白胨（pH值7.0）中，通過緩慢濾過和多次粉刺沖洗抽干后，采用鑷子取膜，并輕貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，以倒置培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)，并測定菌落數(shù)。計(jì)數(shù)公式為：各菌株回收率=[（觀察組的菌落平均數(shù)-供試品對照組的菌落平均數(shù)）/菌液對照組的菌落平均數(shù)]。見表1。

2.3.2?霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)?將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經(jīng)滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應(yīng)的菌液，嚴(yán)格根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》[7]，使其終濃度的菌落數(shù)<100 cfu/mL，經(jīng)過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入100 mL無菌氯化鈉-蛋白胨（pH值7.0）中，通過緩慢濾過和多次粉刺沖洗抽干后，采用鑷子取膜，并輕貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，以20～25 ℃的培養(yǎng)溫度進(jìn)行培養(yǎng)，并測定菌落數(shù)。計(jì)數(shù)公式為：各菌株回收率=[（觀察組的菌落平均數(shù)-供試品對照組的菌落平均數(shù)）/菌液對照組的菌落平均數(shù)]。見表2。

2.4?柴芩清熱口服液檢測控制菌試驗(yàn)?根據(jù)控制菌檢驗(yàn)方法[8-9]，首先采用移液管將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經(jīng)滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應(yīng)的大腸埃希菌菌液，使其終濃度的菌落數(shù)<100 cfu/mL，經(jīng)過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，并嚴(yán)格根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》[7]中控制菌檢驗(yàn)方法檢查。見表3。

2.5?5個(gè)不同批次柴芩清熱口服液樣品檢測結(jié)果5批柴芩清熱口服液的微生物計(jì)數(shù)結(jié)果顯示需氧菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)均<10 cfu/mL，而在控制菌檢查試驗(yàn)結(jié)果中5批柴芩清熱口服液中大腸埃希菌均未檢出。見表4、表5。

3?討論

柴芩清熱口服液處方中主要藥物組成為山銀花、薄荷、法半夏、柴胡、連翹、蘆竹根、黃芩、青蒿、荊芥、板藍(lán)根等;其中黃芩苷、連翹、柴胡和山銀花均具有較強(qiáng)的抑菌性，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有體外抑菌的作用[10-12]，該研究中主要選擇的菌種為金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷對這些菌均有明顯的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌的抗菌作用強(qiáng)于對革蘭氏陰性菌的抗菌作用;薄荷對霉菌具有明顯的抑制作用[13];而其中具有較強(qiáng)抗菌作用和較廣抗菌譜的當(dāng)屬柴胡，研究發(fā)現(xiàn)[14-16]柴胡能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和溶血性鏈球菌等，對痢疾桿菌和白色念珠菌也有一定的抗菌作用;山銀花具有抗病毒的作用，同時(shí)板藍(lán)根的抗菌研究中發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠膿桿菌均由不同程度的抑制作用[17-19]。雖然從柴芩清熱口服液的主要成分中可窺見其抑菌性，但仍必須按照《中華人民共和國藥典》有關(guān)規(guī)定要求進(jìn)行微生物限度的適用性試驗(yàn)，以科學(xué)的方法和態(tài)度保證柴芩清熱口服液藥物的安全性。

微生物限度檢查法在細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)的過程中可能有明顯抑菌的品種，在控制菌的檢查過程中可以采用直接接種法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法，其中最為方便常用的直接接種法就能檢出試驗(yàn)菌株，如果存在對抑菌活性較強(qiáng)而常規(guī)方法不能排除的制劑品種，則多選用薄膜過濾法。我們在柴芩清熱口服液微生物限度試驗(yàn)研究過程中，在比較選用直接接種法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)前2種試驗(yàn)方法均存在干擾現(xiàn)象，而采用薄膜過濾法取得的測試結(jié)果干擾性較小，進(jìn)一步加強(qiáng)了本研究結(jié)果的客觀性，為使本研究檢查結(jié)果獲得良好的

準(zhǔn)確性和重復(fù)性，不僅保持等量的培養(yǎng)基注入體積，且均采用薄膜過濾法進(jìn)行檢測和驗(yàn)證，每次驗(yàn)證需進(jìn)行3次獨(dú)立完整的平行試驗(yàn)。

為了減少微生物限度檢查中的干擾因素，故本研究采用逐層遞進(jìn)的研究方法進(jìn)行研究。首先采用的是需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)，菌株回收率計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的菌株回收率計(jì)數(shù)分別為1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。緊接著對霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行檢測，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)中結(jié)果顯示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分別是0.89和0.89。值得注意的是，在2015版的《中華人民共和國藥典》中菌株回收率是用數(shù)值表示而不是百分比，藥典中規(guī)定回收值在0.5～2.0之間均屬于合格的范疇;這點(diǎn)有別于2010版《中華人民共和國藥典》，其采用的是百分比的形式來表示菌株回收率，并規(guī)定當(dāng)菌株回收率不低于70%時(shí)才符合合格的標(biāo)準(zhǔn)。而在5個(gè)不同批次的柴芩清熱口服液需氧菌總數(shù)<10，符合2015版《中華人民共和國藥典》中<102的規(guī)定，5個(gè)不同批次柴芩清熱口服液霉菌和酵母菌總數(shù)均<10，也符合2015版《中華人民共和國藥典》中<101的規(guī)定;且5個(gè)不同批次柴芩清熱口服液中均未檢出大腸埃希菌。研究結(jié)果符合2015版《中華人民共和國藥典》對口服液制劑的微生物限度的規(guī)定。

參考文獻(xiàn)

[1]王淑梅，李凌霞.中藥治療風(fēng)熱感冒的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（6）：1075-1077.

[2]王海鋒，朱濤，楊海燕，等.四逆清帶口服液穩(wěn)定性研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2018，25（1）：60-62.

[3]王玲，郭志廷，楊峰，等.中藥常山口服液微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（11）：3365-3371.

[4]楊曉莉，李輝，馬英英，等.中華人民共和國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，10（6）：1101-1107.

[5]楊曉莉，李輝，馬英英，等.《中華人民共和國藥典》2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19（4）：748-752.

[6]楊曉莉，李輝，繩金房，等.2015年版《中華人民共和國藥典》無菌檢查法解讀[J].中國藥業(yè)，2015，24（24）：7-11.

[7]李趣嫦，江艷芳.《中華人民共和國藥典》2010版與2015版微生物限度檢查法對四種藥物檢測結(jié)果的比較[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2015，16（2）：86-90.

[8]陳志禹，席時(shí)東.《中華人民共和國藥典》2010年版和2015年版大腸埃希菌檢查方法的比較研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，8（6）：813-815.

[9]邱春梅，解忠雷，王洋.快速定量檢測大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌方法[J].現(xiàn)代儀器與醫(yī)療，2015，21（1）：70-73.

[10]劉彬，盧軍.黃芩苷對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的體外抑菌作用研究[J].安徽醫(yī)藥，2016，20（2）：244-245，246.

[11]肖紅俠，張喜霞，邵世峰，等.黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌抑菌作用的研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2017，35（4）：291-292.

[12]劉一鑫，薛禾菲，許海艦，等.不同方法制備黃芩苷及其鎂鹽體外抑菌實(shí)驗(yàn)[J].天津藥學(xué)，2016，28（4）：1-3，78.

[13]韓琳，曾榮妹，劉波.瓶裝薄荷水生產(chǎn)中霉菌控制分析及改進(jìn)措施研究[J].飲料工業(yè)，2013，16（8）：21-25.

[14]范釗，陳遇英.中藥不同提取方法對2種病原菌的抑制研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，29（3）：29-34.

[15]陳謙峰，謝斌.大柴胡湯古方新用舉隅[J].光明中醫(yī)，2017，32（10）：1496-1497.

[16]Su YY，Tang H，Li XW，et al.Identification of Common Edible and Medicinal Mushrooms by DNA Barcoding[J].World J Tradit Chin Med，2016，2（3）：10-16.

[17]李芳芳，馬麗俐.復(fù)方銀花散塌漬療法為主治療尋常型銀屑病瘙癢30例療效觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2016，51（10）：717-718.

[18]阮健，陳彤.板藍(lán)根類制劑抑菌生物效價(jià)測定方法的研究[J].藥物分析雜志，2016，10（2）：261-266.

[19]楊春望.板藍(lán)根藥理研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10（9）：282-283.

（2019-04-30收稿?責(zé)任編輯：王明）