袁 飛，王新樂(lè)，張 燦，吳顯寧，徐美青

程序性死亡分子- 1(programmed death- 1，PD- 1)為B7家族新成員[1- 2]，常表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞等表面。PD- L1為其配體之一，是由CD274基因編碼的CD28/CTLA4家族的免疫抑制蛋白。PD- 1與腫瘤表面的PD- L1結(jié)合后，既可抑制T細(xì)胞活化信號(hào)，也可向激活的T細(xì)胞傳導(dǎo)抑制信號(hào)，達(dá)到抑制T細(xì)胞殺傷功能的目的，從而在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[3- 4]。腫瘤抗原特異性T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性及誘導(dǎo)凋亡是腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。阻斷PD- 1和PD- L1的結(jié)合可部分恢復(fù)T細(xì)胞功能，抗PD- 1/PD- L1單克隆抗體在多種腫瘤的治療中也已顯示出巨大優(yōu)勢(shì)，這使PD- 1/PD- L1信號(hào)通路的研究成為近年熱點(diǎn)。該研究采用流式細(xì)胞技術(shù)分析檢測(cè)79例非小細(xì)胞肺癌(non- small cell lung cancer,NSCLC)患者腫瘤組織和癌旁組織CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面PD- 1的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，以期為肺癌的研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2017年8月～2018年6月在安徽省立醫(yī)院接受手術(shù)的NSCLC患者79例，其中男56例，女23例，年齡38～82(66.01±9.72)歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。病理類(lèi)型腺癌46例，鱗癌33例；腫瘤直徑≤3 cm患者42例，>3 cm患者37例；病理分期I/II期56例，III期23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。患者均接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治性手術(shù)；有完整臨床資料；術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療。取79例患者的肺癌腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的78例患者的腫瘤遠(yuǎn)端2 cm以上癌旁組織(其中1例癌旁組織標(biāo)本損壞)待測(cè)。

1.2 儀器和試劑Attune NxT 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；腫瘤消化儀、腫瘤消化試劑盒(貨號(hào)：130- 095- 929)購(gòu)自德國(guó)Milteny公司；紅細(xì)胞裂解液(貨號(hào)：R7757)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；死活細(xì)胞鑒定染料(Fixable Viability Stain 780，F(xiàn)VS780，貨號(hào)：565388)、Fc受體阻斷劑(Human BD Fc Block，貨號(hào)：564219)、流式緩沖液(Brilliant stain buffer，貨號(hào)：563794)、轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白試劑(Transcription Factor Buffer Set，貨號(hào)：562574)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1腫瘤樣本的處理 ① 手術(shù)采集的腫瘤樣本稱(chēng)重、記錄；② 根據(jù)腫瘤消化試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，將腫瘤組織消化分解成單個(gè)細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后洗滌，1 400 r/min離心10 min，棄上清液；③ 加入紅細(xì)胞裂解液(5 ml/g腫瘤)室溫裂解紅細(xì)胞3～5 min，用含血清培養(yǎng)基終止裂解紅細(xì)胞；加入PBS充分洗滌及離心，棄上清液。

1.3.2流式染色 ① 加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞密度與活力；② 根據(jù)染色方案，每孔轉(zhuǎn)移1×106個(gè)細(xì)胞入96孔V底板；③ 加入PBS充分洗滌及離心，棄上清液；④ 死活染料FVS780用PBS 1 ∶1 000稀釋后每孔加入100 μl，室溫避光放置10～15 min；加入PBS充分洗滌2次，4 ℃、1 400 r/min離心5 min，棄上清液；⑤ Fc受體阻斷劑用流式緩沖液1 ∶200稀釋后每孔加入100 μl，4 ℃避光孵育20 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清液；⑥ 每孔100 μl加入對(duì)應(yīng)的抗體混合物進(jìn)行細(xì)胞膜染，4 ℃避光孵育40 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清液；⑦ 根據(jù)染色方案，需要核內(nèi)染色的樣品孔用轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白試劑進(jìn)行固定、破膜與染色。加入破膜緩沖液充分洗滌及離心，棄上清液。最后加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清液；⑧ 細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，4 ℃避光孵育30 min；加入流式緩沖液充分洗滌及離心，棄上清液；⑨ 每孔細(xì)胞加入200 μl流式緩沖液重懸，4 ℃避光儲(chǔ)存，上流式機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織PD- 1+細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平比較腫瘤組織PD- 1+細(xì)胞占所有細(xì)胞百分比顯著高于癌旁組織(P<0.01)。腫瘤組織CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞占腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞百分比均顯著高于癌旁組織(P<0.01)，見(jiàn)表1。

項(xiàng)目腫瘤組織癌旁組織t值P值PD-1+細(xì)胞(%)4.80±4.101.47±2.036.463<0.01CD4+T細(xì)胞(%)24.13±11.8711.94±8.137.514<0.01CD8+T細(xì)胞(%)15.25±8.9710.98±7.493.236<0.01

2.2 NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織CD4+和CD8+T細(xì)胞上PD- 1表達(dá)水平的比較腫瘤組織CD4+T細(xì)胞PD- 1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)。腫瘤組織CD8+T細(xì)胞PD- 1表達(dá)水平較癌旁組織也顯著增高(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖1、2。

表2 PD- 1在腫瘤及癌旁組織T細(xì)胞表達(dá)水平比較

圖1 PD- 1在腫瘤及癌旁組織T細(xì)胞表達(dá)水平散點(diǎn)圖

圖2 PD- 1在腫瘤及癌旁組織T細(xì)胞表達(dá)水平流式細(xì)胞檢測(cè)圖

A：腫瘤組織CD4+T細(xì)胞中PD- 1表達(dá)情況；B：癌旁組織CD4+T細(xì)胞中PD- 1表達(dá)情況；C：腫瘤組織CD8+T細(xì)胞中PD- 1表達(dá)情況；D：癌旁組織CD8+T細(xì)胞中PD- 1表達(dá)情況

2.3 不同臨床病理特征的NSCLC患者腫瘤組織CD4+和CD8+T細(xì)胞表面PD- 1表達(dá)水平的比較PD- 1在腫瘤組織中CD4+和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與性別、年齡、分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PD- 1在腫瘤組織CD4+T細(xì)胞表達(dá)與肺癌病理類(lèi)型無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PD- 1在腫瘤組織CD8+T細(xì)胞表達(dá)與病理類(lèi)型有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PD- 1在腫瘤組織中CD4+和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與腫瘤大小有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 腫瘤組織PD- 1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系

3 討論

NSCLC占原發(fā)性肺癌的85%以上[6]，且發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病原因與吸煙、環(huán)境污染、遺傳等因素有關(guān)，但肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前仍不十分清楚。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤免疫抑制是其中重要一環(huán)，PD- 1與配體的結(jié)合在正常情況下可抑制自身免疫應(yīng)答從而避免自身免疫性疾病的發(fā)生，當(dāng)惡性腫瘤患者PD- 1表達(dá)水平升高并與其配體結(jié)合后可營(yíng)造高度免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，削弱機(jī)體的免疫應(yīng)答，并可分泌抑制性分子，同時(shí)介導(dǎo)負(fù)性共刺激信號(hào)達(dá)到免疫逃逸目的[7]，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)有研究顯示，在一些惡性腫瘤組織中，PD- 1表達(dá)明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，惡性腫瘤患者外周血PD- 1較健康人表達(dá)也明顯升高，提示了PD- 1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。呂淑貞 等[8]對(duì)93例乳腺癌腫瘤組織標(biāo)本PD- 1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)生存期進(jìn)行隨訪，結(jié)果表明，PD- 1在癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，且PD- 1陽(yáng)性表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間低于PD- 1陰性患者，表明PD- 1高表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)。張峰 等[9]報(bào)道食管癌組織中PD- 1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，PD- 1陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。針對(duì)于NSCLC，采取外周血并應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)患者CD4+和CD8+T細(xì)胞PD- 1表達(dá)水平的研究有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其結(jié)果與乳腺癌、食管癌等研究結(jié)果基本一致[10]，但應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)直接檢測(cè)肺癌腫瘤標(biāo)本的研究較少，相對(duì)于外周血檢測(cè)，本研究能夠更加直接的反映腫瘤微環(huán)境中的狀態(tài)，結(jié)果顯示，NSCLC患者腫瘤組織CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上PD- 1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，表明腫瘤可能通過(guò)誘導(dǎo)PD- 1高表達(dá)抑制腫瘤組織的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能，營(yíng)造低免疫狀態(tài)的腫瘤微環(huán)境，從而有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤>3 cm患者PD- 1表達(dá)水平顯著高于腫瘤≤3 cm患者，關(guān)于腫瘤大小與PD- 1的關(guān)系，Huang et al[11]相關(guān)研究表明，盡管PD- 1療法在人類(lèi)黑色素瘤中取得了成功，但是部分患者沒(méi)有明顯獲益，這些患者的治療失敗不僅僅是不能誘導(dǎo)免疫恢復(fù)，而是由于T細(xì)胞恢復(fù)和腫瘤負(fù)擔(dān)之間的不平衡。與治療前腫瘤負(fù)擔(dān)相關(guān)的循環(huán)CD8+T細(xì)胞再生程度與臨床反應(yīng)相關(guān)，結(jié)合本研究表明，腫瘤大小影響PD- 1表達(dá)水平，同時(shí)亦是影響PD- 1抗體免疫治療效果的因素之一。另外，本研究發(fā)現(xiàn)肺鱗癌CD8+T細(xì)胞表面PD- 1表達(dá)高于肺腺癌，而在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，提示肺鱗癌細(xì)胞對(duì)于直接殺傷腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞即CD8+T細(xì)胞的抑制強(qiáng)于肺腺癌，目前，相關(guān)研究報(bào)道不多，進(jìn)一步的探索或許對(duì)于免疫治療有一定參考價(jià)值。PD- 1表達(dá)水平與性別、年齡、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。

綜上所述，PD- 1在NSCLC患者腫瘤組織T細(xì)胞表面高表達(dá)，參與腫瘤的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其與腫瘤大小等臨床因素有關(guān)，這些可能為肺癌的研究提供一定的參考依據(jù)。