FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬對(duì)膿毒癥的影響

楊勇，高甜甜，吳狄凌，伍國(guó)寶，黃佳，李金秀

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

膿毒癥是全身性炎癥反應(yīng)綜合征，是急危重患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生的主要因素包括大的手術(shù)，感染及嚴(yán)重?zé)齻萚1]。膿毒癥病程發(fā)展迅速，其發(fā)病率及病死率居高不下，是重癥醫(yī)學(xué)所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[2]。早期的研究顯示，膿毒癥的發(fā)生主要是由于過度炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡，大量炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）等釋放，導(dǎo)致組織及器官的損害[3-4]。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)膿毒癥的發(fā)病過程十分復(fù)雜，涉及機(jī)體炎癥、免疫和凝血功能障礙等多個(gè)方面，同時(shí)，其對(duì)細(xì)胞功能代謝的影響也越來(lái)越受到關(guān)注[5]。膿毒癥致死率較高，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，近年來(lái)，其發(fā)病機(jī)制的研究具有一定的臨床參考價(jià)值，深入且全面了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床診斷治療及預(yù)后具有重要意義[6]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）是最大的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)及脂質(zhì)合成，離子穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞器之間通訊中發(fā)揮重要功能[7]。為滿足細(xì)胞在不同應(yīng)激下的功能，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，其中自噬在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。2015年研究發(fā)現(xiàn)，在真核細(xì)胞中存在的某些特殊蛋白可以介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)選擇性程序性降解，其中FAM134B 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白，可以通過與LC3 Ⅱ相互作用，幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂，形成小的片段從而被自噬體包裹，并與溶酶體融合降解[10-11]。早期對(duì)FAM134B基因的研究中發(fā)現(xiàn)，其在感覺神經(jīng)疾病患者中存在突變，F(xiàn)AM134B敲除小鼠同樣可以表現(xiàn)出這種感覺缺陷。在這些小鼠中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在痛覺感知神經(jīng)元細(xì)胞體中累積無(wú)法有序降解，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受損[10-11]?，F(xiàn)在越來(lái)越多的研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在很多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的功能，本研究利用膿毒癥大鼠及細(xì)胞模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)病的中的功能及相關(guān)機(jī)制。通過檢測(cè)膿毒癥大鼠腦組織及相關(guān)細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B表達(dá)及分布，自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步了解FAM134B 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD 大鼠，體重250～300 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，N2a 細(xì)胞系來(lái)源于ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），LC3 抗體、Activated-Caspase-3 抗體、Caspase-3 抗體、LC3 抗體、Beclein1抗體及FAM134B 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin 抗體、脂多糖（LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，BSA 蛋白定量試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，引物購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其他相關(guān)生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型的復(fù)制 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）方法誘發(fā)SD 大鼠膿毒癥，使用4 ml/kg 水合氯醛通過腹腔注射麻醉，打開腹腔，在離盲腸4 cm處結(jié)扎，CLP 6 h 后注射抗生素，同時(shí)觀察大鼠相關(guān)改變，確定為膿毒癥大鼠模型[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[行政許可決定書文號(hào)：SYXK（湘）2017-0002]。

1.2.2 膿毒癥大鼠模型中腦部組織總RNA 及總蛋白的提取 SD 大鼠分為兩組，正常大鼠組（對(duì)照組）及CLP 誘發(fā)膿毒癥大鼠組（CLP組），每組8 只。在不同處理后，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉和灌注固定，剝?nèi)∈竽X。將大鼠的頭部剪下，用剪刀剝?nèi)∑つw，再用鑷子和剪刀將大鼠腦外堅(jiān)硬的外膜剝除，小心地取出完整的腦部，加入1 ml 的Trizol，勻漿研碎，室溫5 min。加入200 μl 氯仿，劇烈搖蕩離心管，4℃、11 600 r/min 離心10 min；轉(zhuǎn)移水相于一新EP 管，加0.7 倍體積異丙醇，4℃、11 600 r/min 離心10 min；棄上清液，加入1 ml 75%酒精，混勻，4℃、11 600 r/min 離心2 min，重復(fù)2 遍；棄上清，室溫干燥5 min，溶于DEPC 水中，測(cè)光密度（OD）值。同時(shí)取一部分腦部于勻漿器中，加入適量的蛋白酶抑制劑的SDS 裂解緩沖液中，冰上勻漿后靜置20 min，轉(zhuǎn)移至EP 管中，4℃、11 600 r/min離心5 min，取上清液即得到腦組織的總蛋白。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)FAM134B mRNA 的表達(dá) Trizol 法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 檢測(cè)FAM134B、β-actin mRNA 的Ct 值，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火34 s，40 個(gè)循環(huán)；做熔解曲線。以各基因Ct值與β-actin mRNA Ct 值的差值為△△Ct，計(jì)算各基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，并以正常組為參照做歸一處理，其他各組與其做比較。

1.2.4 N2a 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 N2a 細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS 加DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳CO2，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)使用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。研究LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組、10 mg/L LPS 處理組及20 mg/L LPS 處理組；研究過表達(dá)FAM134B 對(duì)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組、20 mg/L LPS 處理組及FAM134B 過表達(dá)+20 mg/L LPS處理組[FAM134B OE+ LPS（20 mg/L）組]。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè)FAM134B、LC3、Beclin1及Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá) 利用BSA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，并不同樣品取等量的蛋白質(zhì)（20 μg）；12% SDS-Page 變性膠電泳，條件為80 V，20 min 后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳90 min；恒流290 mA 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，孵育使用相關(guān)一抗，4℃振搖過夜；次日5% PBST 洗膜，10 min，4 次；孵育對(duì)應(yīng)的二抗，振搖1 h，5% PBST 洗膜，10 min，3 次；暗房曝光顯影，并進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)FAM134B 亞細(xì)胞分布 培養(yǎng)的N2a 細(xì)胞胰蛋白酶消化后接種至24 孔板爬片中，經(jīng)不同處理后，使用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton/PBS進(jìn)行滲透打孔后；5% BSA/PBS 進(jìn)行封閉；一抗室溫孵育1 h；PBS 洗5 次，5 min/次；孵育相對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h；PBS 洗5 次，5 min/次；Dapi 染細(xì)胞核3 min，轉(zhuǎn)移反扣至載玻片上，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察及拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B的表達(dá)情況

采用CLP 方法成功復(fù)制膿毒癥大鼠模型，對(duì)照組FAM134B mRNA 表達(dá)水平為（1.000±0.223），CLP組為（0.430±0.251），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.229，P=0.032），CLP組FAM134B mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組。對(duì)照組和CLP組FAM134B FAM134B 蛋白表達(dá)水平分別為（0.398±0.112）和（1.000±0.185），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 5.021，P=0.019），CLP組中FAM134B 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，見圖1。

圖1 膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B 的表達(dá)情況

2.2 LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡

免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組中，F(xiàn)AM134B 主要呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布，同時(shí)，在20mg/L LPS 處理組中，可以看到在細(xì)胞質(zhì)中FAM134B 呈現(xiàn)很多點(diǎn)狀分布，在LPS 處理后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成及降解穩(wěn)態(tài)被破壞，大量不能降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集在細(xì)胞中。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，各組FAM134B、LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 處理組FAM134B蛋白總量下降，10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組FAM134B 蛋白總量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LPS 處理組FAM134B 蛋白總量下降。同時(shí)，10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LPS 處理組增加。10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組凋亡相關(guān)蛋白Activated Caspase-3 表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LPS 處理組高于對(duì)照組。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡率，對(duì)照組、10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率分別為（4.87±1.24）%、（11.12±1.33）%及（20.85±3.72）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.400，P =0.000），10mg/L LPS 處理組、20mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2和表1。

2.3 過表達(dá)FAM134B 對(duì)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡

表1 不同濃度LPS 處理N2a 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 不同濃度LPS 處理N2a 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對(duì)照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 10 mg/L LPS 處理組 1.88±0.244? 1.92±0.252? 2.21±0.312?20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449? 3.87±0.321? 4.56±0.572?F 值 69.220 95.422 88.635 P 值 0.000 0.000 0.000

過表達(dá)FAM134B 后LPS 處理，各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過表達(dá)FAM134B 后處理LPS，F(xiàn)AM134B OE+LPS（20mg/L）組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 及凋亡相關(guān)蛋白Activated Caspase-3 與20mg/L LPS 處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)AM134B OE+LPS（20mg/L）組的表達(dá)量減少。利用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀分析，對(duì)照組、20mg/L LPS 處理組、FAM134B OE+LPS（20 mg/L）組凋亡率分別為（4.87±1.24）%、（20.85±3.72）%及（9.65±2.67）%，經(jīng)單因素方差析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.180，P =0.000）；FAM134B OE+LPS（20mg/L）組細(xì)胞凋亡與20 mg/L LPS 處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)AM134B OE+LPS（20 mg/L）組較20 mg/L LPS 處理組細(xì)胞凋亡率減少，F(xiàn)AM134B 對(duì)LPS 對(duì)細(xì)胞損害具有一定保護(hù)作用，見圖3和表2。

圖3 過表達(dá)FAM134B 減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害

表2 過表達(dá)FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 過表達(dá)FAM134B 后各組LC3-Ⅱ、Beclin1、Activated Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與20 mg/L LPS 處理組比較，P ＜0.05。

組別 LC3-Ⅱ Beclin1 Activated Caspase-3對(duì)照組 1.00±0.134 1.00±0.183 1.00±0.153 20 mg/L LPS 處理組 3.95±0.449① 3.87±0.321① 4.56±0.572①FAM134B OE+ LPS（20 mg/L）組 0.95±0.119② 0.87±0.154② 1.06±0.172②F 值 72.341 65.883 76.982 P 值 0.000 0.000 0.000

3 討論

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在膿毒癥發(fā)病中起到重要作用[13]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α 等促炎癥因子[14]。該炎癥因子可誘發(fā)過量的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，促使細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)LPS 和促炎因子誘導(dǎo)細(xì)胞激活iNOS 活性，增加過氧化物水平，可直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等病理生理?yè)p害[15-16]。

之前的膿毒癥發(fā)病機(jī)制研究較多的關(guān)注炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激及線粒體損傷在膿毒癥發(fā)病中的作用，較少考慮到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在膿毒癥發(fā)病中的功能[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞生命中一個(gè)重要的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，且其參與細(xì)胞中膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)等，參與線粒體功能的維持[19-20]。FAM134B 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)重要蛋白，2015年研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過與LC3B 相互作用，幫助將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂，形成小片段從而被自噬體包裹，并與溶酶體融合降解，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白FAM134B 表達(dá)下降；LPS 誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及細(xì)胞凋亡且過表達(dá)FAM134B減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞凋亡及功能維持等生命過程中發(fā)揮重要作用，其與多種疾病相關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病，缺血再灌注損傷，糖尿病等[9]。阿爾茲海默相關(guān)基因PS-1突變可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而導(dǎo)致神經(jīng)元退行性死亡[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以降低帕金森病相關(guān)基因Parkin 的表達(dá)，影響其對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白如α-synuclein 等的清除，α-synuclein 蛋白的異常聚集是導(dǎo)致帕金森病發(fā)生的重要特征[22]。缺氧缺血可以導(dǎo)致異常折疊蛋白的聚集從而產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在灌注后使受損組織發(fā)生氧化應(yīng)激，NO 和其他活性氧生成增加，鈣離子通道受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。胰島B 細(xì)胞具有成熟發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成系統(tǒng)，其可分泌大量的胰島素及其他糖蛋白，嬰兒型糖尿病相關(guān)基因PERK 缺失，其可影響胰島B 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促使JNK 信號(hào)通路的異常活化，導(dǎo)致胰島素合成障礙[24]。

自噬是是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要反應(yīng)，過度自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡[25]。研究顯示LPS誘導(dǎo)的膿毒癥細(xì)胞模型自噬水平增加，細(xì)胞凋亡增多，其主要可以通過IL-lα、IL-1β、IL-6 以及TNF-α等促炎癥因子發(fā)揮功能，也可誘導(dǎo)線粒體自噬，細(xì)胞能量代謝異常導(dǎo)致[26-27]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，LPS 處理中，F(xiàn)AM134B 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分布發(fā)生異常，成聚集點(diǎn)狀分布，其可能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬而聚集無(wú)法降解相關(guān)，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，且在過表達(dá)FAM134B 后此現(xiàn)象得到改善，說(shuō)明FAM134B能減少LPS 對(duì)細(xì)胞的損害，進(jìn)一步證實(shí)FAM134B 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬影響膿毒癥的發(fā)生，為深入了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。