腦梗死患者動脈粥樣硬化程度與載脂蛋白A5-1131T/C、553G/T2位點的關系*

郭生龍，李鵬，雷琦

（陜西省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710068）

腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，是由多種原因導致的局部腦組織區(qū)域發(fā)生血液供應障礙，引起腦組織缺血、缺氧性病變，從而產(chǎn)生的一系列臨床癥狀，是一種具有極高病死率和致殘率的疾病[1]。動脈硬化被認為是導致腦梗死的重要因素之一，而甘油三酯（Triglycerides,TG）的升高已經(jīng)證實是導致動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素[2]。隨著研究進一步深入，載脂蛋白A5（ApoA5）與動脈硬化被認為具有一定的關系，本研究觀察陜西省人民醫(yī)院腦梗死患者的動脈粥樣硬化程度和ApoA5-1131T/C、553G/T 2 個位點的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般研究

隨機選取2015年1月—2017年1月陜西省人民醫(yī)院腦梗死患者120 例進行臨床研究。所有患者符合全國第4 屆腦血管病學術會議制定的診斷標準，并經(jīng)頭CT 和頸部超聲確定診斷。其中，男性77 例，女性43 例；年齡58～79 歲，平均（72.33±5.14）歲。研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準[3]：①病程為72 h 內(nèi)；②病變部位僅限于頸內(nèi)動脈供血區(qū)域；③既往無中風病史；④患者或者患者家屬對本研究知情同意。排除標準[4]：①合并其 他系統(tǒng)、器官、部位炎癥病變的患者；②既往有腦出血或者腦梗死病史的患者；③合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心房顫動、心肌梗死、肝腎衰竭的患者；④合并大動脈炎等動脈系統(tǒng)疾病的患者；⑤來診前1個月內(nèi)有炎癥抑制藥物或者免疫抑制劑應用史患者；⑥有自身免疫系統(tǒng)疾病病史的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 頸動脈超聲檢查 所有患者給予頸動脈血管超聲檢查?；颊呷⊙雠P位、頸部充分暴露，常規(guī)檢查患者的雙側頸總動脈、頸動脈分叉部、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。掃查血管壁、血管斑塊形成的數(shù)量、大小、性質、血管狹窄程度。測量頸總動脈內(nèi)膜-中層厚度（common carotid artery intima-media thickness,CCA-IMT）和 頸內(nèi)動脈內(nèi)膜-中膜厚度（internal carotid artery intimamedia thickness,ICA-IMT）。

1.3.2 基因DNA 提取 使用EDTA-K2 抗凝試管取患者靜脈血1 ml，提取基因組DNA，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP） Trizol 購自美國Gibco BRL 公司，Taq酶購自大連寶生物公司，模板RNA 2 μg、M-MLV 逆轉錄酶購自美國Promega 公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，UVIpro 凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國KODAK 公司。將標本通過Trizol 方法提取組織總RNA。PCR 反應條件：①-1131T/C 位點，96℃預變性2 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)30 次，72℃繼續(xù)延伸5 min。②553G/T 位點，95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火40 s，72℃延伸50 s，共循環(huán)35 個，72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR 擴增產(chǎn)物10LL 在-1131T/C 位點加入限制性內(nèi)切酶MseI 5 u，553G/T 位點加入MspI 5 u，37℃消化4 h。PCR 反應產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro 凝膠圖像分析系統(tǒng)進行攝像、掃描、分析。

1.3.4 血脂相關指標檢查 取患者清晨空腹靜脈血3 ml，檢測其TG、低密度脂蛋 白（low-density lipoprotein,LDL）、 高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）、血清總膽固醇（total cholesterol,TC）水平。上述所有指標由本院生化實驗室進行檢測，儀器為7060 全自動血生化儀（日本日立公司），嚴格按照儀器說明書要求進行操作。

1.4 分析指標

觀察-1131T/C 位點和553G/T 位點間的CCA-IMT和ICA-IMT 間的差異，觀察-1131T/C 位點和553G/T 位點不同基因型的TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。比較常見單倍型配對間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較

-1131T/C 位點基因型為CC 的患者與基因型為TT+TC 的患者CCA-IMT 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；-1131T/C 位點基因型為CC 的患者與基因型為TT+TC 的患者ICA-IMT 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），CC 基因型的ICA-IMT 高于TT+TC 基因型。見表1。

2.2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較

553G/T 位點基因型為GG 與TT+GT 基因型的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

表1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

表1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

基因型 n CCA-IMT ICA-IMT CC 13 1.10±0.27 1.06±0.13 TT+TC 107 1.06±0.33 0.91±0.14 t 值 0.420 3.678 P 值 0.675 0.000

表2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

表2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

基因型 n CCA-IMT ICA-IMT GG 102 1.09±0.22 0.95±0.14 TT+GT 18 1.12±0.27 1.01±0.18 t 值 0.515 1.603 P 值 0.608 0.112

2.3 -1131T/C 位點不同基因型患者的血脂水平比較

-1131T/C位點基因型CC與TT+TC位點患者TC、HDL-C、LDL-C 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），-1131T/C 位點基因型CC 與TT+TC 位點TG 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CC 位點TG水平高于TT+TC 水平。見表3。

2.4 553G/T 位點不同基因型患者的血脂水平比較

553G/T 位點基因型GG 與TT+GT 位點患者TC、TG、HDL-C 及LDL-C 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 常見單倍型配對間的CCA-IMT 和ICA-IMT水平比較

TG-TG、TG-CG、TG-CT、CG-CG 的CCA-IMT水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而ICA-IMT水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中CG-CG型最高，TG-CG 型最低。見表5。

表3 -1131T/C 位點不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

表3 -1131T/C 位點不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

基因型 n TC TG HDL-C LDL-C CC 13 4.15±0.22 2.20±0.19 1.07±0.18 2.25±0.15 TT+TC 107 4.20±0.18 1.77±0.23 1.04±0.13 2.27±0.12 t 值 0.923 6.471 0.751 0.552 P 值 0.358 0.000 0.454 0.582

表4 553G/T 位點不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

表4 553G/T 位點不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

基因型 n TC TG HDL-C LDL-C GG 102 4.13±0.15 1.71±0.25 1.15±0.06 2.47±0.18 TT+GT 18 4.20±0.20 1.59±0.62 1.12±0.12 2.42±0.16 t 值 1.731 1.432 1.634 1.103 P 值 0.086 0.158 0.105 0.272

表5 常見單倍型配對間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比較（mm，±s）

表5 常見單倍型配對間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比較（mm，±s）

單倍型配對 n CCA-IMT ICA-IMT TG-TG 52 1.03±0.18 0.99±0.13 TG-CG 41 1.02±0.04 0.96±0.18 TG-CT 10 1.04±0.10 1.07±0.10 CG-CG 17 1.08±0.08 1.14±0.06 F 值 1.106 3.447 P 值 0.092 0.018

3 討論

載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質部分，其作用是遇血脂結合并運輸?shù)綑C體各個組織中進行代謝，以及進行蛋白質利用[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白基因發(fā)生突變，形成不同等位基因多態(tài)性，而不同表型的載脂蛋白對血脂的代謝和利用會發(fā)生不同影響，進而對機體產(chǎn)生影響，對患者高脂血癥、動脈粥樣硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生和發(fā)展起到一定作用。目前研究認為，載脂蛋白具有促進脂類運輸、調(diào)節(jié)酶活性、同細胞表面結合等作用，是一組在功能上非?；钴S的血漿蛋白[6-7]。

載脂蛋白主要分為A、B、C、D、E 5 個種類，在肝臟和小腸中合成。其中載脂蛋白在分子量、免疫性和代謝上均呈現(xiàn)出多態(tài)性，在HDL 中含量最多，是構成血漿HDL 的重要組成部分，具有清除組織脂質和抗動脈粥樣硬化的作用[8-9]。

ApoA5 是載脂蛋白超家族的新成員，是在2001年由2 個不同的研究小組先后于載脂蛋白A1、載脂蛋白C3、載脂蛋白A4 的基因簇中所鑒定出來，而且研究發(fā)現(xiàn)人類的載脂蛋白A5 的基因與小鼠的載脂蛋白A5 基因的同源性能夠達到71%，但是與人類載脂蛋白A4 的基因同源性僅為27%[10]。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管其濃度較低，但是對降低血漿TG 具有重要意義，同時研究發(fā)現(xiàn)與肥胖和代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展具有密切關系[11]。人類的ApoA5 是由343 個氨基酸殘基所組成，結構中具有多個雙性的A-螺旋結構，同時也包含有B 折疊和B 轉角結構[12]。A-螺旋結構是ApoA5 的活性中心，在疏水性和長度上出現(xiàn)非常大的差異性，使用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測后發(fā)現(xiàn)ApoA5 在極LDL、HDL、乳糜微粒中均有存在，因此被認為在調(diào)節(jié)富含TG 脂蛋白代謝過程中具有重要作用，并認為可能存在一個機制，使其循環(huán)再利用，從而彌補ApoA5 在外周循環(huán)中出現(xiàn)的含量不足的問題[13]。

-1131T/C 位點和553G/T 位點被認識是影響ICA- IMT 厚度變化的基因型，這一機制可能與-1131CC 基因型具有誘導頸內(nèi)動脈內(nèi)膜變厚的作用，553GG 基因對CCA-IMT 具有一定影響，這一機制可能與患者基因表達蛋白質不同有所關聯(lián)。-1131CC 基因型所表達的蛋白質具有血脂在頸內(nèi)動脈的內(nèi)膜中沉積的作用，而553TT+GT 基因型所表達出的蛋白具有促進血脂在頸總動脈沉積的作用[14-15]。如果能確定不同基因在人體血脂沉積過程中起到的作用，也就為動脈粥樣硬化的基因治療提供了新的思路。

從本研究來看，-1131T/C 位點基因型中CC 與TT+TC 基因型的CCA-IMT 無差異，-1131T/C 位點基因型中CC 與TT+TC 基因型的ICA-IMT 有差異，CC的ICA-IMT 高于TT+TC，說明-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用，該作用可能通過誘導血脂在頸內(nèi)動脈內(nèi)膜中沉積的作用。而553G/T 位點基因型中GG 與TT+GT 基因型的CCA-IMT 與ICA-IMT 無差異，說明553G/T 位點基因型對CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度增加并無明顯作用。-1131T/C 位點基因型CC 與TT+TC 位點TC、HDL-C、LDL-C 水平無差異，但CC位點TG 水平高于TT+TC 水平有差異，說明-1131T/C 位點基因型CC 對TC、HDL-C、LDL-C 水平無影響，但能夠影響TG 水平的升高，這也與-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用相符合。而553G/T 位點基因型GG 與TT+GT 位點患者TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平無差異，說明553G/T 位點基因型未改變CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度的作用。在常見單倍型配對間的CCAIMT 和ICA-IMT 水平影響中，TG-TG、TG-CG、TGCT、CG-CG 的CCA-IMT 無差異，而ICA-IMT 水平有差異，其中CG-CG 型最高，TG-CG 型最低。說明不同的單倍型配對會影響ICA-IMT 厚度，這也成為促使動脈粥樣硬化發(fā)展的重要因素。

綜上所述，載脂蛋白A5 基因-1131T/C 和553G/T 兩個位點與腦梗死患者的動脈硬化程度聯(lián)系緊密，能夠促使血脂在頸動脈和頸內(nèi)動脈中發(fā)生沉積，從而誘導動脈硬化發(fā)生、發(fā)展，因此對基因的研究有可能為動脈硬化的預防與治療提供新的思路，值得進一步深入研究，而ApoA5 作為新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白超家族的成員，仍然有大量的研究工作需要進行，以便觀察其在腦梗死患者動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。