蘇春艷，阮艷，彭誠

(1天津市職業(yè)病防治院，天津300000；2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球腫瘤的第六位。雖然近年OSCC的治療取得了一定進(jìn)展，但是OSCC患者5年生存率仍為40%左右[1]，其病死率無降低趨勢。因此，開發(fā)治療OSCC的新藥至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA，廣泛表達(dá)于各種組織，其在惡性腫瘤組織中的異常表達(dá)有重要意義[2，3]，可作為藥物靶點進(jìn)行抗腫瘤治療[4，5]。研究證實，在多種腫瘤組織中miR-195為抑癌基因[6，7]，其在OSCC組織中通過靶向RAF1基因抑制腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。miRNA具有多個靶基因，并通過不同的靶基因調(diào)控不同的下游通路，發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。而腫瘤惡性行為最重要的特征為惡性增殖，即細(xì)胞生長不受控制。2017年6月～2018年12月，本研究探討miR-195過表達(dá)對OSCC細(xì)胞增殖的影響及其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人OSCC細(xì)胞系SCC-4、SACC-83、Cal-27購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和FBS購自美國gibco公司；miR-195 mimic、成纖維細(xì)胞生長因子7(FGF7)過表達(dá)質(zhì)粒、突變型(mut)與野生型(wt)FGF7的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)熒光素酶報告載體(FGF7-wt、FGF7-mut)購自中國上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；采用細(xì)胞活力測定(MTS)試劑購自美國Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-195、FGF7、內(nèi)參U6和GAPDH引物購自上海捷瑞生物工程有限公司；RIPA購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；pPI3K抗體(ab40755)、pAKT抗體(ab81283)和GAPDH抗體(ab9485)購自英國Abcam公司。RNA濃度測定儀Nanodrop2000和酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞融合度為95%左右傳代。qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)miR-195表達(dá)，與正常人口腔黏膜成纖維細(xì)胞系HOMF細(xì)胞比較，SCC-4、SACC-83、Cal-27細(xì)胞中miR-195相對表達(dá)量低，且SCC-4細(xì)胞中最低。因此以SCC-4細(xì)胞作為實驗細(xì)胞。SCC-4細(xì)胞長至融合度為80%左右將其鋪至6孔板中，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機分為對照組、miR-195 mimic組、vector+miR-195 mimic組、FGF7+miR-195mimic組。將對照試劑、miR-195 mimic試劑分別與脂質(zhì)體2000混合后按說明書轉(zhuǎn)染至對照組、miR-195 mimic組，將FGF7過表達(dá)對照vector+miR-195 mimic試劑、FGF7過表達(dá)+miR-195 mimic試劑分別轉(zhuǎn)染至miR-195 mimic+vector組、miR-195 mimic+FGF7組，放至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 SCC-4細(xì)胞增殖檢測 采用MTS實驗。將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以每孔2 000個細(xì)胞、150 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于細(xì)胞貼壁后的第1、2、3、4天加入MTS工作液30 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測樣品在490 nm波長處的吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 miR-195的靶基因檢測 采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?。用Target Scan7.2生物學(xué)信息軟件預(yù)測miR-195與FGF7的3′-UTR區(qū)存在結(jié)合位點。將培養(yǎng)好的SCC-4細(xì)胞隨機分為4組：FGF7-wt與miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-wt+miR-195)、FGF7-wt與對照共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-wt+vector)、FGF7-mut與miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-mut+miR-195)、FGF7-mut與對照共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-mut+vector)，分別完成轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.5 SCC-4細(xì)胞內(nèi)miR-195、FGF7 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR實驗。采用TRIzol法裂解細(xì)胞提取總RNA，并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，進(jìn)行熒光定量PCR。分析各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，miR-195相對表達(dá)以U6為內(nèi)參基因，F(xiàn)GF7相對表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。miR-195上游引物序列：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物序列：5′-TGCTGTGCCAGCTGCAGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。FGF7上游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，下游引物序列：5′-CAGGGCTGGAACAGTTCACAT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′。

1.6 SCC-4細(xì)胞內(nèi)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(pPI3K)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting實驗。SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，加入適量的含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA，充分混勻后冰上裂解20 min，14 000 r/min、4 ℃離心30 min，測定蛋白濃度，煮沸變性，行SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，8%脫脂牛奶封閉1 h，置于一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，二抗稀釋液室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值。實驗重復(fù)3次,取平均值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值

2 結(jié)果

2.1 miR-195過表達(dá)對SCC-4細(xì)胞增殖能力的影響 細(xì)胞貼壁后第1天miR-195 mimic組細(xì)胞增殖能力對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第3、4天miR-195 mimic組細(xì)胞增殖能力較對照組低(P均<0.05)。見表1。

表1 miR-195過表達(dá)對SCC-4細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 miR-195的靶基因 FGF7-wt+對照共轉(zhuǎn)染組、FGF7-Wt+miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染組、FGF7-mut+對照、FGF7-mut+miR-195 mimic組熒光素酶活性分別為1.00±0.02、0.28±0.04、1.00±0.05、0.92±0.11。與FGF7-wt+對照共轉(zhuǎn)染組比較，F(xiàn)GF7-Wt+miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性低(P<0.05)；而FGF7-mut+對照組與FGF7-mut+miR-195 mimic組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組、miR-195 mimic組FGF7 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.05、0.25±0.13，miR-195 mimic組FGF7 mRNA相對表達(dá)量較對照組低(P<0.05)。證實FGF7為miR-195的靶基因。

2.3 FGF7對miR-195介導(dǎo)的抑制SCC-4細(xì)胞增殖作用的影響 細(xì)胞貼壁后第1天miR-195 mimic+FGF7組細(xì)胞增殖能力與miR-195 mimic+vector組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第2、3、4天miR-195 mimic+FGF7組細(xì)胞增殖能力較miR-195 mimic+vector組高(P均<0.05)。見表2。

表2 FGF7對miR-195介導(dǎo)的抑制SCC-4細(xì)胞增殖作用的影響

2.4 miR-195過表達(dá)對SCC-4細(xì)胞內(nèi)pI3K、pAKT蛋白表達(dá)的影響 對照組、miR-195 mimic組、miR-195 mimic+FGF7組pI3K蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.05、0.28±0.04、0.33±0.08，pAKT蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.05、0.14±0.05、0.31±0.10。miR-195 mimic組pI3K、pAKT蛋白相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)，miR-195 mimic+FGF7組pI3K、pAKT蛋白相對表達(dá)量高于miR-195 mimic組(P均<0.05)。

3 討論

靶向治療已經(jīng)應(yīng)用于肺癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等一些惡性腫瘤的治療[11]，而尚未有療效明確的靶向藥物用于治療OSCC。OSCC發(fā)病機制復(fù)雜多變，目前尚未完全闡明，但是癌基因激活、抑癌基因失活和表觀遺傳學(xué)修飾的改變已經(jīng)明確與OSCC的發(fā)病密切相關(guān)[12]，因此從分子水平研究OSCC的發(fā)病機制，尋找靶基因為OSCC靶向藥物開發(fā)提供新的方向。

miR-195屬于miR-15/107家族成員[6，7]，miR-195可增強結(jié)直腸癌對放射和化學(xué)藥物的敏感性，被一致認(rèn)為是腫瘤增殖的抑制劑，在抗腫瘤方面具有較好的前景[13]。miR-195可抑制OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8,14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-195過表達(dá)對SCC-4細(xì)胞增殖有抑制作用。

miRNA通過與靶基因3′-UTR結(jié)合抑制靶基因翻譯或RNA降解來調(diào)控靶基因的表達(dá)，miRNA的靶基因可以為數(shù)個至幾十個，通過靶向不同的靶基因發(fā)揮不同的調(diào)控作用[9]。郭芳等[8]報道，miR-195通過直接靶向抑制RAF1基因調(diào)控OSCC細(xì)胞的增殖及遷移、侵襲。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-195靶向TRIM14基因抑制OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。FGF7是FGFs家族的重要成員，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，發(fā)揮癌基因的生物學(xué)表型[15，16]。本研究用Target Scan7.2生物學(xué)信息軟件預(yù)測FGF7是miR-195調(diào)控的直接靶基因，在SSC-4細(xì)胞中miR-195抑制FGF7 mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建FGF7過表達(dá)質(zhì)粒，與miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染SSC-4細(xì)胞，結(jié)果顯示FGF7可以逆轉(zhuǎn)miR-195的抑制作用，證實了miR-195通過負(fù)調(diào)控FGF7發(fā)揮抑制SSC-4細(xì)胞增殖的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-195靶向FGF7抑制SSC-4細(xì)胞增殖的作用，其具體的機制仍需進(jìn)一步研究。腫瘤增殖失控導(dǎo)致惡性增殖是腫瘤發(fā)生的重要機制，在該過程中多種信號通路被激活，包括Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等經(jīng)典信號通路[17]。其中在腎透明細(xì)胞癌組織中miR-195靶向VEGFR2抑制PI3K/Akt和Raf/ME/ERK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]；在乳腺癌組織中FGF7與FGFR2結(jié)合激活PI3K/AKT信號通路[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-195 mimic與FGF7過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中pPI3K、pAKT蛋白的表達(dá)升高。表明miR-195抑制SSC-4增殖的作用機制可能通過靶向負(fù)調(diào)控FGF7的表達(dá)抑制PI3K/AKT信號通路激活。

綜上所述，miR-195在OSCC細(xì)胞中低表達(dá)，其低表達(dá)可抑制OSCC細(xì)胞增殖能力，可能的作用機制為靶向下調(diào)FGF7基因表達(dá)進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號通路的活性。本研究為miR-195作為治療OSCC的潛在藥物靶點提供了實驗依據(jù)。