OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的篩選鑒定及外源基因拷貝數(shù)的初步分析

杜京堯 尚飛 王高華

摘要：水稻Rho GDP解離抑制基因OsRhoGDI2是從幼穗中分離出的功能未知基因。為鑒定該基因的功能，筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP，并對水稻進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。對OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代進(jìn)行篩選和鑒定，采用PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因植株，采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測OsRhoGDI2在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，其中6個(gè)株系為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，OsRhoGDI2表達(dá)水平上調(diào)1.69～13.35倍。為檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的拷貝數(shù)，分別以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG為內(nèi)參基因和標(biāo)記基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)結(jié)合內(nèi)參基因和標(biāo)記基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在所檢測的6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，外源基因的拷貝數(shù)均為1，提示已經(jīng)獲得穩(wěn)定遺傳的OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，為后續(xù)OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：OsRhoGDI2;轉(zhuǎn)基因水稻;表達(dá)分析;拷貝數(shù);外源基因

中圖分類號： S511.03 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0050-04

植物Rho/Rac也稱為Rop（Rho of plant），是植物中唯一與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的小GTP結(jié)合蛋白，功能涉及細(xì)胞極性生長[1-3]、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組[4-5]、次生壁形成[6]、分生組織信號傳遞[7]以及抗逆和激素應(yīng)答[8-11]等。作為信號通路的分子開關(guān)，Rho蛋白通過與靶蛋白的相互作用，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)控和影響，已明確的一類相互作用蛋白是Rho GDP解離抑制因子（Rho GDP dissociation inhibitors，RhoGDIs），功能是調(diào)節(jié)Rho的胞內(nèi)定位，通過阻止GTP與Rho的結(jié)合，抑制Rho的活化，因而是Rho的負(fù)調(diào)控因子[12-14]。但是目前對植物RhoGDIs研究的報(bào)道較少，雖有從擬南芥、煙草、水稻等植物中篩選到RhoGDIs的報(bào)道[15-17]，但是對其在植物生長發(fā)育等過程中生物學(xué)功能的研究非常有限。Carol等對擬南芥突變體scn1的研究發(fā)現(xiàn)，一種擬南芥的RhoGDI基因SCN1/AtrhoGDI1通過控制局部RHD2/AtrbohC NADPH氧化酶的激活，調(diào)控根毛細(xì)胞的生長[18];Wu等的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtRhoGDI1通過ROP信號通路，介導(dǎo)對幼苗和葉表皮細(xì)胞形態(tài)建成的調(diào)節(jié)，而且AtRhoGDI1被CPK3磷酸化是執(zhí)行其功能的前提[19]，但是至今尚未見水稻RhoGDIs基因功能的報(bào)道。

水稻Rho GDP解離抑制基因OsRhoGDI2是通過酵母雙雜交篩選，從雌雄蕊形成期水稻幼穗中分離的功能未知基因。對該基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位檢測發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白在活細(xì)胞中廣泛分布[20]。對OsRhoGDI2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因功能鑒定的研究表明，該基因2 100 bp的上游調(diào)控序列即可以啟動(dòng)GUS在穎花、花藥和花粉中的特異表達(dá)，該基因的表達(dá)受到生長素（IAA）等多種激素的脅迫和誘導(dǎo)[21]。為了進(jìn)一步鑒定OsRhoGDI2的功能，本研究基于實(shí)驗(yàn)室的前期工作，對OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代進(jìn)行篩選和鑒定，分別采用PCR、RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)在DNA和RNA水平上進(jìn)行檢測，并通過qPCR技術(shù)鑒定OsRhoGDI2在轉(zhuǎn)基因株系中的拷貝數(shù)，旨在為后續(xù)分析OsRhoGDI2基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 水稻粳稻品種日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare），簡稱WT，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與分子育種實(shí)驗(yàn)室提供;OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，簡稱OE-OsRhoGDI2，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，已篩選獲得T1代種子，遺傳背景為日本晴。

1.1.2 載體 植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑RNAiso Plus、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自寶生物工程（大連）有限公司，2×Es Taq MasterMix （Dye）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)所用引物（表1）均由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻取材 選取適量的對照（WT）水稻種子和OE-OsRhoGDI2水稻T1代種子，2016年5月1日播種于河南師范大學(xué)試驗(yàn)園地（113.90°E、35.32°N）。水稻生長至 20 d （幼苗期）、90 d（抽穗期）時(shí)，分別取其植株葉片，液氮冷凍處理，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 OsRhoGDI2轉(zhuǎn)基因植株的篩選 取幼苗期水稻嫩葉，采用十六烷基三甲基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA。以F1/R1為引物，基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照2×Es Taq MasterMix說明書配制反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq Master Mix 5.0 μL、F1（10 μmol/L）0.4 μL、R1（10 μmol/L）0.4 μL、基因組DNA 0.2 μL 和無菌水4.0 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 OsRhoGDI2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)水平的檢測

1.2.3.1 總RNA的提取和cDNA的制備 取抽穗期水稻葉片，根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司RNAiso Plus試劑說明書，分別提取對照（WT）水稻和OE-OsRhoGDI2水稻T2代幼苗葉片總RNA，然后按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。

1.2.3.2 半定量RT-PCR 以“1.2.3.1”節(jié)獲得的cDNA為模板，按照PrimeSTAR HS DNA Polymerase說明書配制半定量RT-PCR反應(yīng)體系（50 μL），其中內(nèi)參基因UBQ的PCR擴(kuò)增體系為5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ Plus）10.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL、UBQ引物F2（10 μmol/L）1.0 μL、UBQ引物R2（10 μmol/L）1.0 μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL、cDNA模板2.0 μL和無菌水31.5 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。OsRhoGDI2的擴(kuò)增體系引物采用F1/R1，其余同UBQ的PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)退火溫度為58 ℃，其余參數(shù)同UBQ的PCR反應(yīng)條件。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取“1.2.3.1”節(jié)制備的cDNA為模板，以F3/R3為引物進(jìn)行OsRhoGDI2的qRT-PCR反應(yīng)，以水稻OsAct1基因?yàn)閮?nèi)參，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書配制反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、PCR Forward primer（10 μmol/L）0.8 μL、PCR Reverse primer（10 μmol/L）0.8 μL、cDNA 2.0 μL、滅菌水 6.4 μL。采用2步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：第1步95 ℃預(yù)變性 30 s;第2步PCR反應(yīng)95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

每組試驗(yàn)做3次重復(fù)，利用Roche LightCycler 96自帶軟件LightCycler 96 v1.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以2-ΔΔCT法[22]分析OsRhoGDI2基因表達(dá)水平。

1.2.4 OsRhoGDI2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中拷貝數(shù)的鑒定 HYG基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考楊立桃等的方法[23]，以含有HYG基因的pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP質(zhì)粒DNA溶液（107、106、105、104、103拷貝/μL）為模板，以F5/R5為引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進(jìn)行配制，反應(yīng)體系同“1.2.3.3”節(jié)。采用2步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，其余參數(shù)同“1.2.3.3”節(jié)。得到等梯度拷貝數(shù)對應(yīng)的CT值。依據(jù)CT值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間的一定的線性關(guān)系來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。水稻內(nèi)參基因SPS標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考Ding等的方法[24]。

以6個(gè)陽性O(shè)E-OsRhoGDI2水稻基因組DNA為模板，分別以F5/R5和F6/R6為引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進(jìn)行配制，反應(yīng)體系同“1.2.3.3”節(jié)。采用2步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，其余參數(shù)同“1.2.3.3”節(jié)。分別獲得6個(gè)植株HYG與SPS基因的CT值，并由HYG與SPS基因的相關(guān)性方程計(jì)算其起始模板數(shù)。用純合二倍體水稻SPS作為內(nèi)參基因，將H0與S0的比值乘以2得到OsRhoGDI2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsRhoGDI2轉(zhuǎn)基因水稻的篩選

以水稻基因組DNA為模板，用引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定陽性轉(zhuǎn)基因植株。由于OsRhoGDI2轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體內(nèi)插入的目的基因長度為795 bp，所以從陽性轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA中能擴(kuò)增出 795 bp 特異片段，而對照（WT）植株中不能擴(kuò)增出該大小的條帶。電泳結(jié)果顯示，在檢測的15個(gè)樣品中，除了3、8、11號之外，都可以擴(kuò)增得到預(yù)期大小的片段，且與陽性對照條帶位置一致（圖1），說明OsRhoGDI2基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。

2.2 OsRhoGDI2在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)水平的檢測

選取PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻，提取葉片總RNA，采用半定量RT-PCR檢測該基因的表達(dá)水平，內(nèi)參采用水稻泛素（UBQ）基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在對照（WT）水稻葉片中，OsRhoGDI2基因的表達(dá)水平較低，而在所檢測的7株轉(zhuǎn)基因水稻中，OsRhoGDI2基因的表達(dá)水平均有不同程度的提高，尤其是7、9、10、12、16號這5株的表達(dá)量有顯著的增高（圖2），說明這5株水稻是OE-OsRhoGDI2陽性植株。

進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測OsRhoGDI2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)水平。由圖3可知，除2號外，在其余6株轉(zhuǎn)基因水稻中OsRhoGDI2基因的表達(dá)水平均比對照（WT）高，基因表達(dá)量極顯著上調(diào)的有6號（1.69倍）、16號（2.69倍）、10號（4.02倍）、12號（5.98倍）、9號（9.72倍）和7號（13.35倍），且與半定量RT-PCR檢測結(jié)果一致，證明OsRhoGDI2基因在這些轉(zhuǎn)基因水稻中實(shí)現(xiàn)了過量表達(dá)。

2.3 HYG基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以含有HYG基因的pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP質(zhì)粒DNA溶液（107、106、105、104、103拷貝/μL）為模板，基于qPCR數(shù)據(jù)獲得了HYG基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），其相關(guān)系數(shù) r=0.999 7，說明相關(guān)性高。其CT值與起始模板數(shù)（H0）之間的相關(guān)性方程為：H0=10（-0.297CT+12.356）。

2.4 OsRhoGDI2在轉(zhuǎn)基因水稻中拷貝數(shù)的測定

以上述鑒定的6株陽性O(shè)E-OsRhoGDI2水稻基因組DNA為模板，分別以F5/R5和F6/R6引物組合，對HYG基因與SPS基因進(jìn)行qPCR，獲得擴(kuò)增曲線與待測樣品的CT值（表2），并由HYG與SPS基因的相關(guān)性方程計(jì)算其起始模板數(shù)。

OsRhoGDI2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的拷貝數(shù)的計(jì)算結(jié)果顯示，對照水稻拷貝數(shù)為0，其余有6個(gè)OE-OsRhoGDI2水稻拷貝數(shù)均為1（表3）。

3 結(jié)論與討論

植物遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)作物改良和基因功能研究的常用試驗(yàn)方法。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，對OsRhoGDI2轉(zhuǎn)基因水稻T2代進(jìn)行了篩選和鑒定，獲得6個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因水稻株系?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，過表達(dá)后代中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性的主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，外源基因拷貝數(shù)為1或2時(shí)能夠穩(wěn)定遺傳高表達(dá)，而外源基因拷貝數(shù)過多（達(dá)4～5）往往使外源基因不表達(dá)甚至導(dǎo)致基因沉默[25-26]。因此在獲得陽性過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株后，對其外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行鑒定分析是必要的。

本研究對外源基因拷貝數(shù)的檢測所采用的內(nèi)參基因?yàn)樗咎赜械膯慰截惢騍PS[24]，轉(zhuǎn)基因植株的標(biāo)志基因是植物表達(dá)載體的標(biāo)志基因HYG，也是轉(zhuǎn)基因植物篩選常用的標(biāo)志。檢測結(jié)果顯示，OsRhoGDI2在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻中均為單拷貝，提示基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，這與筆者所在實(shí)驗(yàn)室對其T1代和T2代的連續(xù)篩選結(jié)果是一致的，陽性率均在85%以上。

本研究采用基因組DNA擴(kuò)增的方法，首先檢測了OsRhoGDI2過表達(dá)植物載體是否穩(wěn)定整合到水稻基因組中，進(jìn)而采用半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平檢測了OsRhoGDI2在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)水平，并通過外源基因拷貝數(shù)的測算，證實(shí)外源OsRhoGDI2基因整合到水稻基因組中的拷貝數(shù)均為1。本研究篩選和鑒定了6個(gè)獨(dú)立的OsRhoGDI2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，為后續(xù)以這些材料開展對OsRhoGDI2的功能鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。

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