姜福貴， 李 俊， 沈成華， 陳勁松， 蔣文昊

黔東南州人民醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，貴州 凱里 556000

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，常導(dǎo)致不可逆性的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能喪失[1]。目前，臨床治療采用手術(shù)治療、藥物治療及基因治療等，雖能使脊髓功能得到某種程度的恢復(fù)，但均無(wú)法有效解決患者截癱這一難題[2]。隨著神經(jīng)生物學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞移植有望成為治療脊髓損傷的有效方法[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)具有自我更新能力及多向分化潛能，除能分化為基質(zhì)細(xì)胞外，還能在體內(nèi)外分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[4-5]。BMSCs移植治療脊髓損傷具有很好的療效，而移植后BMSCs的存活是細(xì)胞移植治療發(fā)揮作用的關(guān)鍵[6]。Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，能對(duì)抗多種因素造成的細(xì)胞凋亡[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因轉(zhuǎn)染可提高BMSCs在惡性環(huán)境中的耐受力，提升其存活率[8]。本研究將Bcl-2修飾的BMSCs通過(guò)靜脈注射的方式移植入脊髓損傷大鼠體內(nèi)，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究該治療方式的療效及相應(yīng)作用機(jī)制，旨在為臨床采用BMSCs移植治療脊髓損傷提供理論參考?，F(xiàn)報(bào)道如下

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康成年雌性大鼠150只，平均體質(zhì)量為(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022。乙醚(東莞市億鑫化工有限公司)，α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，胎牛血清(上海素爾生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海雅心生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司)，原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑴c分組 建立脊髓損傷大鼠模型。麻醉大鼠，以胸10椎體為中心做約4 cm的縱向切口，充分顯露胸10棘突，棘突上放置一圓形薄塑料墊片，在Allen′s裝置上安裝10 g重錘，啟動(dòng)裝置使重錘自由下落，撞擊墊片造成脊椎沖傷[9]。造模后，運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(basso beattie bresnahan，BBB)<8分即為造模成功。造模成功108只，隨機(jī)分模型組、BMSCs組、BMSCs+Bcl2組，每組36只，另選取36只正常大鼠作為對(duì)照組。

1.2.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)和傳代 取成年清潔級(jí)SD大鼠，利用DEME沖洗股骨髓腔，并加入Ficoll-Paque分離液離心得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞。CD抗原測(cè)定結(jié)果顯示CD44、CD90呈陽(yáng)性，CD14、CD34呈陰性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞具備BMSCs的生物學(xué)特性。繼續(xù)傳代培養(yǎng)以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用。

1.2.3 Bcl2轉(zhuǎn)染BMSCs及BMSCs細(xì)胞移植 取對(duì)數(shù)期BMSCs細(xì)胞，向其中加入含Ad-EGFP-Bcl-2或Ad-EGFP的病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs，利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒? d后進(jìn)行BMSCs細(xì)胞移植，BMSCs組及BMSCs+Bcl2組大鼠24 h后經(jīng)尾靜脈分別注射3×103個(gè)/μl BMSCs和Bcl2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs懸浮液1 ml。對(duì)照組及模型組大鼠尾靜脈注入等量生理鹽水。在BMSCs移植后的12周后，處死大鼠，取出損傷部位脊髓，制成組織切片，HE染色后觀察組織切片。

1.3 觀察指標(biāo) 采用BBB評(píng)分分別于建模前3d及移植術(shù)后1、2、4、6、8、12周對(duì)各組大鼠進(jìn)行大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，其中后肢無(wú)運(yùn)動(dòng)功能為0分，后肢運(yùn)動(dòng)功能完全正常為21分。在移植術(shù)后14 d，選取各組大鼠脊髓損傷節(jié)段采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。在高倍鏡下選取5個(gè)100 mm3區(qū)域，計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取平均值。在細(xì)胞移植術(shù)后1、2、3周，采用免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament 200，NF-200)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrous acidic protein，GFAP)表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算Bcl-2、NF-200及GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs感染及移植結(jié)果 細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 d時(shí)GFP的表達(dá)最理想，可見(jiàn)大量綠色熒光。隨后對(duì)脊髓損傷大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)BMSCs組大鼠、Bcl2+BMSCs組大鼠脊髓損傷部位可見(jiàn)大量綠色熒光。見(jiàn)圖1。

圖1各組細(xì)胞熒光成像圖片(HE×100,a.BMSCs組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4 d；b.細(xì)胞移植1周后白光下脊髓損傷部位切片；c.細(xì)胞移植1周后綠色熒光聚集在脊髓損傷部位，BMSCs向損傷部遷移)

2.2 4組大鼠Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 在細(xì)胞移植術(shù)后1、2、4周后，模型組和DMSCs組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量較低，而B(niǎo)cl2+BMSCs組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量呈持續(xù)較高水平，顯著高于同時(shí)段的對(duì)照組、模型組及DMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 脊髓組織切片TUNEL染色情況 模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(18.68±3.74)個(gè)，顯著高于對(duì)照組的(6.85±2.03)個(gè)；BMSCs組及Bcl2+BMSCs組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(13.56±2.48)個(gè)和(9.31±2.74)個(gè)，顯著低于模型組；Bcl2+BMSCs組顯著低于BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 4組大鼠脊髓組織細(xì)胞 NF-200及GFAP蛋白陽(yáng)性面積比例移植治療后，模型組NF-200陽(yáng)性面積比例為(14.66%±2.03%)，低于對(duì)照組的(49.36%±4.56%)，GFAP陽(yáng)性面積比例為(16.87%±2.03%)，高于對(duì)照組的(4.02%±0.16%)；Bcl2+BMSCs組NF-200陽(yáng)性面積比例為(34.54%±3.65%)，高于模型組及DMSCs組的(21.32%±2.34%)，GFAP陽(yáng)性面積比例為(6.01%±1.02%)，低于模型組及DMSCs組的(9.86%±2.14%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 4組大鼠Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖3 4組大鼠NF-200及GFAP蛋白陽(yáng)性面積比(TUNEL染色×100)

2.5 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià) 移植治療4、6、8、12周后，BMSCs組及Bcl2+BMSCs組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均顯著高于模型組，且Bcl2+BMSCs組顯著高于BMSCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別治療前3 d治療后第1周治療后第2周治療后第4周治療后第6周治療后第8周治療后第12周對(duì)照組20.36±1.0520.57±0.9820.64±0.9420.52±0.8820.76±0.7320.66±0.6520.47±0.78模型組1.27±1.043.13±1.123.65±1.064.39±1.675.68±1.536.52±1.557.23±1.93BMSCs組1.21±0.963.01±1.054.15±1.415.96±1.26①7.12±1.85①9.41±1.23①11.59±1.67①Bcl2+BMSCs組1.41±1.023.68±0.545.36±0.87①8.87±1.63①②10.65±0.97①②11.56±1.42①②15.87±1.26①②

注：與模型組比較，①P<0.05；與BMSCs組比較，②P<0.05

3 討論

BMSCs細(xì)胞移植為臨床治療脊髓損傷提供了新途徑，防止BMSCs細(xì)胞凋亡是移植治療成功的關(guān)鍵，而B(niǎo)cl2修飾可明顯提升BMSCs移植細(xì)胞的存活率[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2+BMSCs組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于模型組和BMSCs組，脊髓組織及脊髓神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組和BMSCs組，其BBB評(píng)分也顯著高于模型組和BMSCs組，證實(shí)Bcl2修飾的BMSCs治療脊髓損傷大鼠能顯著抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)，具有很好的治療效果。

本研究采用GFP對(duì)BMSCs修飾，在顯微鏡下可觀察到大量綠色熒光，隨后將修飾后的BMSCs移植入脊髓損傷大鼠體內(nèi)，1周后在大鼠脊髓損傷部位觀察到大量綠色熒光，說(shuō)明移植后BMSCs能有效向損傷部位遷移。細(xì)胞移植1、2、4周后，Bcl2+BMSCs組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他組。Bcl-2對(duì)抗多種原因引起的細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是能夠抑制細(xì)胞凋亡的“抗凋亡基因”[11]。本研究中，TUNEL染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在治療14 d后，Bcl2+BMSCs組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組及BMSCs組，提示Bcl2+BMSCs細(xì)胞移植治療脊髓損傷能通過(guò)提升大鼠損傷部位Bcl2表達(dá)量來(lái)抑制BMSCs細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植可促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，提升脊髓損傷區(qū)Bcl2基因表達(dá)和降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果一致[12]。

NF-200是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和軸突細(xì)胞骨架的主要成分，脊髓損傷后NF-200陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量及神經(jīng)元胞體著色程度和后肢功能恢復(fù)密切相關(guān)[13]。BMSCs本身不表達(dá)NF-200，只有分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞時(shí)才能表達(dá)NF-200，且NF-200染色程度可直接反映已分化的神經(jīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果顯示，BMSCs組NF-200陽(yáng)性面積比例顯著高于模型組，提示單純的BMSCs移植治療能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，BMSCs在脊髓損傷的微環(huán)境下可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，NF-200陽(yáng)性面積增加。此外，Bcl2+BMSCs組NF-200陽(yáng)性面積比例顯著高于模型組和BMSCs組，同時(shí)結(jié)合BBB評(píng)分可知Bcl2修飾的BMSCs能更好的修復(fù)脊髓損傷，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

GFAP是構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞突起延長(zhǎng)、維持膠質(zhì)細(xì)胞基本形態(tài)的作用，機(jī)體發(fā)生脊髓損傷后，其合成和分泌量均顯著增加，GFAP的含量可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2+BMSCs組GFAP陽(yáng)性面積比例最高，證實(shí)脊髓損傷后大鼠體內(nèi)GFAP表達(dá)量提升。此外，Bcl2+BMSCs組GFAP陽(yáng)性面積比例低于模型組及DMSCs組，提示Bcl2基因修飾BMSCs移植治療脊髓損傷能顯著抑制大鼠脊髓損傷部位GFAP表達(dá)量，從而更好的促進(jìn)軸突再生。其原因可能為Bcl2基因能有效抑制BMSCs細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)BMSCs分化成為神經(jīng)元細(xì)胞，分化的神經(jīng)元細(xì)胞能大量分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并且提供神經(jīng)修復(fù)的骨架結(jié)構(gòu)，從而有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和GFAP表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，Bcl2基因修飾BMSCs移植治療脊髓損傷大鼠能通過(guò)提升損傷部位Bcl2表達(dá)量抑制脊髓細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。