賈鑫淼，肖 盟，孫天舒，徐英春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1中心實(shí)驗(yàn)室 2檢驗(yàn)科， 北京 1007303侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730

格特隱球菌(Cyptococcusgattii)屬于新生隱球菌復(fù)合體(Cryptococcusneoformanscomplex)，既往被認(rèn)為是新生隱球菌復(fù)合體的變種(C.neoformansvar.gattii)，但最終被確立為獨(dú)立的物種[1]。與新生隱球菌不同，格特隱球菌多感染免疫力正常人群[2]。格特隱球菌以擔(dān)孢子和酵母細(xì)胞形態(tài)被吸入，引起人或動(dòng)物肺部感染，再傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦膜炎或腦膜腦炎，感染后具有致命性；除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺部，還可累及皮膚、骨、關(guān)節(jié)、喉淋巴結(jié)、腹腔、前列腺、眼睛、尿路和循環(huán)系統(tǒng)等部位[3]。

格特隱球菌主要分為4個(gè)譜系：VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ[2,4]，其中VGⅡ是最古老的譜系，其次是VGⅣ[5]。通過對(duì)臨床、動(dòng)物和環(huán)境分離株的分析發(fā)現(xiàn)[2,6- 9]：在所有分離株中，最常見的分子類型為VGⅡ，占所有分離株的47%，其次是VGⅠ(34%)、VGⅢ(11%)和VGⅣ(8%)；在臨床分離株中，VGⅠ和VGⅡ具有相似的比例，VGⅢ和VGⅣ次之；而大多數(shù)環(huán)境分離株屬于分子型VGⅡ，其次是VGⅠ和VGⅢ，環(huán)境分離株則很少出現(xiàn)VGⅣ型。

格特隱球菌感染主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。1999年在地處溫帶的加拿大溫哥華島[6]及美國西北部地區(qū)[10]發(fā)生了格特隱球菌暴發(fā)流行，我國及歐洲地區(qū)亦有病例報(bào)道[11- 13]。近期研究顯示，其所致感染病例地理分布正在不斷擴(kuò)大[14]。目前格特隱球菌的致病機(jī)制、毒力作用機(jī)制、暴發(fā)流行和進(jìn)化機(jī)制尚不完全明確，致使安全有效的治療藥物和疫苗開發(fā)處于停滯狀態(tài)。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，針對(duì)格特隱球菌的基因組學(xué)分析將有助于解決這一難題。因此，本文就格特隱球菌的基因組測序和基本特征、基因組進(jìn)化、重要毒力基因以及比較基因組研究予以概述。

1 基因組測序及其基本特征

VGⅠ型的WM276由來自加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)邁克爾·史密斯實(shí)驗(yàn)室的J. Kronstad等于2011年測序完成，基因組組裝基于BAC文庫構(gòu)建的物理圖譜和包含來自BAC克隆末端的測序reads支持完成。WM276基因組長約18.4 Mb，包含8個(gè)gap區(qū)域，8條染色體的兩端鑒定出由基序重復(fù)序列組成的端粒序列(TTAGGGG)n， 4條染色體的一端鑒定出端粒序列，其余2條染色體兩端均未鑒定出端粒序列。其中，最大的染色體2.23 Mb，最小的染色體0.52 Mb，平均G+C含量47.9%，共計(jì)編碼約6560個(gè)基因[15]。

VGⅡ型的R265由Broad研究所測序完成，是Broad真菌基因組計(jì)劃的一部分，該菌株是引起加拿大溫哥華地區(qū)格特隱球菌感染的爆發(fā)菌株。作為NHGRI白皮書的一部分，Broad研究所還對(duì)其他格特隱球菌菌株進(jìn)行了測序，以輔助提高R265的基因組組裝水平。R265基因組約17.5 Mb，G+C含量47.8%，最大的染色體2.21 Mb，最小的染色體0.52 Mb，共編碼約6470個(gè)基因。此外，研究人員還拼接得到了0.03 Mb，G+C含量33.4%的線粒體基因組[15]。

VGⅢ和VGⅣ型別的菌株尚無基因組相對(duì)完整的代表菌株。

2 基因組進(jìn)化特征

早期研究中，格特隱球菌的進(jìn)化分析主要基于少數(shù)基因位點(diǎn)。2008年，Bovers等[5]通過對(duì)6個(gè)基因位點(diǎn)LAC1、ITS1/2、IGS、RPB1、RPB2和TEF1的分析，鑒定VGⅡ?yàn)楦裉仉[球菌菌株的起源，其次是VGⅣ，同時(shí)VGⅣ又為姐妹分支VGⅠ和VGⅢ的起源。除6個(gè)基因位點(diǎn)之外，通過對(duì)線粒體基因組上兩個(gè)基因位點(diǎn)mtlrRNA和ATP6的分析發(fā)現(xiàn)，格特隱球菌不同譜系之間在線粒體基因組上存在較為廣泛的基因重組[16]。利用PCR指紋圖譜對(duì)4個(gè)基因座ACT1、IDE1、PLB1和URA5的分析，進(jìn)一步確認(rèn)VGⅡ?yàn)楦裉仉[球菌最古老的譜系，且4大譜系包含B、C兩個(gè)血清型[17- 18]。對(duì)這4個(gè)基因座的進(jìn)一步分析顯示，格特隱球菌較新生隱球菌位于進(jìn)化的下級(jí)。此外，基于10個(gè)基因位點(diǎn)ACT1、LAC1、IDE1、ITS1/2、IGS、PLB1、RPB1、RPB2、TEF1和URA5，并通過對(duì)進(jìn)化時(shí)間的推算，進(jìn)一步確立了VGⅡ的祖先地位[19]，VGⅡ與其他分支的分離約在6200萬年前(范圍：3300～8700萬年前)，VGⅥ分支與VGⅢ和VGⅠ分支的分離在5200萬年前(范圍：2700～7700萬年前)，VGⅢ和VGⅠ的分離約在4700萬年前(范圍：2600～6700萬年前)(圖1)[2]。

近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組序列分型(whole-genome sequence typing，WGST)得到越來越廣泛的應(yīng)用。2011年，Gillece等[20]對(duì)太平洋西部高毒力VGⅡ型菌株的傳播分析發(fā)現(xiàn)，VGⅡ內(nèi)部具有3種不同亞型的菌株 (VGⅡa、VGⅡb和VGⅡc)，其中VGⅡa遺傳多樣性最高，其次是VGⅡc和VGⅡb，而VGⅡc基因型菌株是引起太平洋西部感染最常見的菌株，在基因組上與溫哥華島爆發(fā)亞型VGⅡa和VGⅡb具有較大差異?；诙辔稽c(diǎn)序列分型和多位點(diǎn)微衛(wèi)星分型分析也具有相似的發(fā)現(xiàn)，并且進(jìn)一步得到WGST的證實(shí)[21- 23]。目前所有研究均表明，VGⅡ3個(gè)亞型的出現(xiàn)是基因組重組的結(jié)果，且重組發(fā)生在進(jìn)入太平洋西部之前。

圖 1格特隱球菌菌株多位點(diǎn)序列分型進(jìn)化樹[2]

此外，VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ在不同地區(qū)的分布具有地區(qū)特異性：(1)美洲：主要為VGⅡ和VGⅢ型，其中大多數(shù)VGⅡ臨床株來自于南美洲[7]。VGⅡ的兩種主要亞型VGⅡa和VGⅡb主要來自加拿大和太平洋西北地區(qū)[6]。此外，新的高毒力亞型VGⅡc也已在俄勒岡州以及太平洋西北地區(qū)被鑒定出來[24]。(2)歐洲：僅有VGⅠ和VGⅡ的報(bào)道，且多數(shù)病例為VGⅠ感染[25]。(3)非洲：雖然對(duì)非洲的格特隱球菌知之甚少，但其流行病學(xué)似乎與世界上其他地區(qū)大不相同，主要是VGⅣ類型菌株，且主要來自非洲南部[26]。(4)亞洲和澳大利亞：主要的分子類型是VGⅠ，其次是VGⅡ，VGⅢ很少被分離出來[27]。

粒子群優(yōu)化算法是模仿鳥群覓食過程而創(chuàng)造的一種仿生全局隨機(jī)搜索方法,其最大特點(diǎn)是具有記憶性和信息共享。粒子群算法在搜索空間隨機(jī)初始化粒子的位置xi={xi1,xi2,…,xin},并根據(jù)粒子位置與個(gè)體極值(即粒子的歷史最優(yōu)位置)以及全局極值(即粒子群的歷史最優(yōu)位置)Pg=[pg1,pg2,…,pgn]建立粒子位移速度vi=[vi1,vi2,…,vin],以不斷的迭代優(yōu)化粒子群的位置,使其最終收斂到一個(gè)理論最優(yōu)位置。

3 重要毒力因子

研究表明，莢膜、黑色素、生理溫度下的生長能力、降解酶以及交配型等與隱球菌致病性緊密相關(guān)[28- 29]。

3.1 莢膜

莢膜由90%～95%的葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖( glucuronoxylomannan，GXM)、5%的半乳糖木糖甘露聚糖和小于1%的甘露糖蛋白構(gòu)成，對(duì)于隱球菌在其宿主中的存活至關(guān)重要，其通過為酵母細(xì)胞提供直接保護(hù)以增加隱球菌的適應(yīng)性。例如，在不存在噬菌素的情況下，莢膜抑制噬細(xì)胞對(duì)隱球菌的吞噬作用[30]，且抵抗吞噬體消化[31]。莢膜多糖亦直接作用于宿主，在巨噬細(xì)胞中，隱球菌將多糖從其莢膜中釋放到吞噬體周圍的囊泡中，且這些囊泡在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙和溶解[31- 32]。

目前已報(bào)道與莢膜生成相關(guān)的基因及其功能包括CAP59(跨膜蛋白，介導(dǎo)GXM的運(yùn)輸)、CAP64(與莢膜生成和宿主致命感染相關(guān))、CAP60/CAP10(編碼定位于核膜和細(xì)胞質(zhì)的蛋白)、CAS1/CAS3(介導(dǎo)GXM乙?；?、UXS1/UGD1/CAS31/CAS32/CAS33/CAS34/CAS35(介導(dǎo)GXM的木糖基化)[29]。

3.2 黑色素

黑色素是一種帶負(fù)電荷的疏水性高分子量顏料，由酚類化合物的氧化聚合形成[33]。在某些鄰二酚化合物如3,4-二羥基苯丙氨酸[34]的存在下，漆酶催化隱球菌中的黑色素合成。研究發(fā)現(xiàn)，從人腦組織中回收的新生隱球菌細(xì)胞是黑化的，產(chǎn)生黑色素的新生隱球菌毒性更高[33]。此外，與黑化的新生隱球菌細(xì)胞相比，非黑化細(xì)胞對(duì)氧化劑的敏感性較高，且易被抗真菌藥物(如卡泊芬凈和兩性霉素B)殺死[35]。由于吞噬作用后氧化劑的產(chǎn)生是免疫細(xì)胞介導(dǎo)抗微生物作用的重要機(jī)制，因此這些結(jié)果表明黑色素可通過保護(hù)真菌細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊來增強(qiáng)毒力。此外，觀察到的黑化新生隱球菌能更好地抵御吞噬作用和抑菌作用，也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

兩種漆酶基因LAC1和LAC2被鑒定為黑色素生物合成的中心酶[29]。其他基因，包括VPH1、CLC1、CCC2、ATX1和MBF1也被發(fā)現(xiàn)是黑色素生成所必需的。

3.3 生理溫度下的生長能力

在生理溫度下的生長能力對(duì)于新生隱球菌和格特隱球菌的毒力是必不可少的。雖然一些隱球菌物種(例如播散隱球菌)也具有膠囊，并產(chǎn)生黑色素，但很少能在37℃下生長，因此不會(huì)在哺乳動(dòng)物中引起感染[36]。隱球菌在鳥糞富集，但鳥類不會(huì)被感染，可能是因?yàn)殡[球菌在40～42 ℃的禽類體溫下不能很好地生存。因此，這種溫度限制是隱球菌致病性的重要決定因素。

早期研究發(fā)現(xiàn)了十幾種高溫生長所必需的基因，包括CNA1、CNB1、CPA1、CCN1、TPS1、TPS2、MGA2、RAS1、SOD2、TSA1、ILV2、SPE3/LYS9、MPK1和STE20等[36]。

3.4 降解酶

3.4.1 蛋白酶

降解包括膠原、彈性蛋白、纖維蛋白、免疫球蛋白和補(bǔ)充因子在內(nèi)的宿主蛋白，引起宿主組織破壞，為隱球菌提供營養(yǎng)物質(zhì)[31]。

3.4.2 磷脂酶

能夠水解甘油磷脂中的一個(gè)或多個(gè)酯鍵，可破壞膜穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解和脂質(zhì)第二信使的釋放[37]。隱球菌分泌的磷脂酶表現(xiàn)出磷脂酶B、溶血磷脂酶水解酶和溶血磷脂酶轉(zhuǎn)酰酶活性。與蛋白酶相同，磷脂酶有助于宿主細(xì)胞膜的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞裂解。在用于感染小鼠的菌株中，磷脂酶表達(dá)與毒力呈劑量依賴性相關(guān)[37]。PLB1基因的破壞導(dǎo)致體內(nèi)毒力降低，抑制巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系中的生長[38]。磷脂酶還可裂解二棕櫚酰磷脂酰膽堿，即一種肺表面活性劑主要成分，從而有助于真菌擴(kuò)散[39]。最近研究表明，新生隱球菌的磷脂酶B增強(qiáng)了新生隱球菌對(duì)人肺上皮細(xì)胞系的黏附[40]和小鼠模型中隱球菌病的傳播[41]。

3.4.3 脲酶

催化尿素水解成氨和氨基甲酸酯，并且是某些致病菌的重要致病因子[39]。隱球菌脲酶(編碼基因：URE1)是重要的毒力因子，用URE1突變株感染的小鼠比用野生型菌株H99感染的小鼠壽命更長[42]。雖然脲酶不是大腦生長所必需的，但靜脈接種URE1突變株后，腦、脾和其他器官的傳播模式與野生型菌株顯著不同，因此提出URE1通過增強(qiáng)微毛細(xì)管內(nèi)的酵母螯合作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)入侵發(fā)揮作用。

3.5 交配型

一些有趣的觀察結(jié)果表明，交配型也是一種毒力因子。首先，MATα細(xì)胞比MATa細(xì)胞更普遍。例如，MATα交配型比MATa在環(huán)境分離株中的含量高40倍，在臨床分離株中的含量高30倍[43]。其次，當(dāng)在隱球菌病的小鼠模型中研究血清型D(除交配型基因座外其他基因相同)菌株JEC21時(shí)，發(fā)現(xiàn)MATα菌株比MATa菌株毒性更高[44]。MATα細(xì)胞比MATa細(xì)胞更普遍和更具毒性的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了對(duì)MATa交配型基因座的分析。最初，僅在MATa菌株中約50 kb的區(qū)域被定義為MATα基因座，且其包含許多α特異性基因，包括STE12a[45]。然而，MAT基因座的實(shí)際大小似乎遠(yuǎn)大于此，在新生隱球菌和格特隱球菌中的長度均超過100 kb，含有>20個(gè)基因，包括那些參與信息素產(chǎn)生、傳感、建立細(xì)胞類型特性、MAP激酶途徑的成分等[46]。

此外，一些基因參與隱球菌多個(gè)致病相關(guān)過程，在隱球菌致病過程中發(fā)揮重要作用(表1)。

4 比較基因組學(xué)研究

不同譜系的格特隱球菌菌株基因組長度(17.32～18.36 Mb)和基因個(gè)數(shù)(6456～6763)差別不大，但譜系之間存在較大的遺傳變異(平均基因組一致性93%，52 SNPs/kb)，而譜系內(nèi)部菌株平均基因組一致性為97%，每kb少于6個(gè)SNPs[47]。格特隱球菌菌株的第一個(gè)全基因組比較分析由D’Souza 等[15]于2011年完成，主要對(duì)單個(gè)VGⅠ分離株WM276(代表導(dǎo)致全球大多數(shù)格特隱球菌感染的分子類型)和VGⅡ分離株R265(代表高毒力VGⅡa溫哥華島爆發(fā)基因型)進(jìn)行了分析。隨著測序和分析技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員逐漸關(guān)注到格特隱球菌各個(gè)譜系的菌株。

4.1 基因組結(jié)構(gòu)

研究表明，4個(gè)譜系菌株染色體結(jié)構(gòu)高度保守，其中VGⅡ尤為保守[47]。幾乎所有的同線性變異都在3個(gè)密切相關(guān)的譜系VGⅠ、VGⅢ和VGⅣ中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大于100 kb的染色體重排約15個(gè)，平均而言，約2.6%的區(qū)域發(fā)生了重排。15個(gè)重排區(qū)域包括10個(gè)易位(7條染色體間和3條染色體內(nèi))和5個(gè)支架融合，其中大多數(shù)(15個(gè)中的13個(gè))與在著絲粒中發(fā)現(xiàn)的TcN轉(zhuǎn)座子簇相關(guān)[48]，表明這些主要是全染色體臂重排。對(duì)更多的菌株基因組的研究進(jìn)一步證實(shí)了存在4種染色體重排，包括VGⅡ特有的染色體融合、VGⅢ獨(dú)有的兩種易位(分別為700 kb和140 kb)以及VGⅣ特有的一種易位(450 kb)。由于一些重排事件會(huì)產(chǎn)生缺失的染色體區(qū)域或其他非整倍體和不可存活的后代，因此這些變化可能影響譜系之間的遺傳交換能力。

除了染色體重排，VGⅡ和VGⅢ譜系菌株中還發(fā)現(xiàn)存在非整倍體[47]。如對(duì)VGⅡ譜系動(dòng)物分離株B8828的研究發(fā)現(xiàn)，scaffold 13擁有額外兩個(gè)拷貝；對(duì)VGⅢ譜系臨床株CA1280的研究發(fā)現(xiàn)，scaffold 2二倍體缺失；對(duì)VGⅡ臨床分離株LA55研究發(fā)現(xiàn)，scaffold 1中具有60 kb的染色體內(nèi)重復(fù)。已有研究顯示，染色體拷貝數(shù)的變異影響新生隱球菌的毒力[49]，且可通過增加唑類藥物靶標(biāo)(ERG11)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AFR1)的拷貝數(shù)進(jìn)一步提高對(duì)唑類藥物的抗性。然而，格特隱球菌分離株中的這類基因似乎沒有更高的拷貝數(shù)，表明這些非整倍體與已知的抗藥性機(jī)制無關(guān)，可能對(duì)這些分離株產(chǎn)生其他影響。

對(duì)線粒體基因組結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組譜系之間的重組比染色體的重組更加頻繁。研究發(fā)現(xiàn)，VGⅠ譜系菌株線粒體基因組序列與VGⅡ的相似性遠(yuǎn)高于核基因組，且對(duì)兩兩譜系Fst值[50]的計(jì)算也表明線粒體基因組[VGⅠ-VGⅢ (0.642), VGⅠ-VGⅣ (0.672), VGⅢ-VGⅣ (0.658)]比核基因組[VGⅠ-VGⅢ (0.885), VGⅠ-VGⅣ (0.894), VGⅢ-VGⅣ (0.885)]重組率更高[49]。

4.2 特異基因

Farrer等[46]涉及4個(gè)譜系16株格特隱球菌菌株的研究發(fā)現(xiàn)了737個(gè)譜系特異或者在2或3個(gè)譜系特異的直系同源基因簇(表2)。這些基因主要來源于許多小的染色體內(nèi)部變化，并在所有染色體散在分布。研究人員進(jìn)一步對(duì)這些基因Pfam結(jié)構(gòu)域和GO的功能富集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)譜系攜帶一類獨(dú)特的基因功能子集，這些基因可能參與毒力和疾病預(yù)后，包括Fe+/Cu+結(jié)合基因，維持或影響線粒體形態(tài)的基因，以及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因。其中，最大GO富集類別為氧化應(yīng)激。

表 1 格特隱球菌重要致病性相關(guān)基因[2]

表 2 不同譜系格特隱球菌特異基因

VGⅠ具有攜帶鐵還原酶樣跨膜組分和鐵還原酶NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因的特異擴(kuò)增。鐵還原酶參與毒力因子黑色素產(chǎn)生和對(duì)唑類抗真菌藥物的抗性[51]?？傮w而言，VGⅠ具有4個(gè)譜系中最少的譜系特異基因，但有12個(gè)顯著富集的Pfam結(jié)構(gòu)域，其中包括被認(rèn)為參與DNA修復(fù)的HORMA結(jié)構(gòu)域的基因擴(kuò)增[52]。

VGⅡ分離株攜帶的特異基因包括涉及膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜分泌載體膜蛋白、Prmt1(Fop)染色質(zhì)相關(guān)蛋白[53]以及在伴侶蛋白中發(fā)現(xiàn)的熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)。在新型隱球菌中，對(duì)HSP70基因家族成員Ssa1的缺失表明，HSP70作為真菌毒力所需的應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄共激活因子起作用[54]。HSP70在VGⅡ分離株中的擴(kuò)增表明其可能是適應(yīng)新環(huán)境的機(jī)制。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，VGⅡ缺失了其他3個(gè)譜系中存在的約150個(gè)基因，比VGⅠ-Ⅲ-Ⅳ譜系中相應(yīng)的基因丟失組合少3倍，進(jìn)一步表明該譜系的基因組隨著時(shí)間推移變得更加穩(wěn)定。這些缺失基因富集的結(jié)構(gòu)域包括PAZ、Piwi和DUF1785，所有這些都是RNA干擾機(jī)制的組成部分[55- 56]。此外，VGⅡ中丟失的基因還包括參與蛋白質(zhì)加工和降解的功能結(jié)構(gòu)域，例如Alg14結(jié)構(gòu)域(N-連接糖基化第二步所需)[57]、兩個(gè)S9肽酶以及后期促進(jìn)復(fù)合物亞基5。VGⅡ菌株還缺失了一半對(duì)核和線粒體基因組維持至關(guān)重要的PIF1樣螺旋酶[58]，這些可能在VGⅡ的不同管狀線粒體形態(tài)中發(fā)揮作用。此外，過氧化物酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞基VIb(COX6B)和鐵蛋白鐵結(jié)合區(qū)2也在VGⅡ分離株特異缺失，其可能參與了隱球菌的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[59]。

VGⅢ分離株約包含70個(gè)譜系特異基因，這個(gè)數(shù)目可能會(huì)隨著VGⅢ測序菌株的增加而減少。目前發(fā)現(xiàn)，VGⅢ特異基因包括對(duì)基因組穩(wěn)定性起重要作用的PIF1樣解旋酶[58]和磷酸丙酮酸水合酶/烯醇酶[60]，這是主要的高度保守的真菌過敏原[60]。此外，葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，包括由多種真菌物種分泌的抗真菌蛋白，在VGⅢ中丟失[61]。含有亮氨酸拉鏈-EF-hand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1(leucine zipper/EF-hand- containing transmembrane protein 1,LETM1)也未在VGⅢ中預(yù)測到，盡管翻譯的BLAST比對(duì)結(jié)果揭示了LETM1樣序列的存在。

VGⅣ主要感染免疫功能低下的宿主，研究表明，VGⅣ具有最多的譜系特異基因，不過VGⅣ譜系菌株也特異缺失了一部分重要基因，如含有Ctr銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族結(jié)構(gòu)域的3個(gè)基因中的一個(gè)，這些基因已被證明可影響肺部感染期間的隱球菌存活和腦膜炎的發(fā)病[62]。VGⅣ缺失的基因還包括3種鹵酸脫鹵素酶的Pfam結(jié)構(gòu)域，其在多種底物上催化碳或磷?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[63]。

4.3 單核苷酸多態(tài)性

目前，針對(duì)格特隱球菌菌株單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的分析主要集中于利用全基因組SNP進(jìn)行格特隱球菌的進(jìn)化研究，深入的細(xì)化和功能研究較少。2014年，Engelthaler等[22]首次對(duì)全球118株格特隱球菌菌株(主要為太平洋西北地區(qū)，115株VGⅡ譜系菌株以及VGⅠ、VGⅢ和VGⅣ譜系各一株)進(jìn)行了全基因組SNP比較分析，在所有基因組中共鑒定出1 282 876個(gè)SNP，544 881個(gè)簡約SNP(區(qū)分不止一個(gè)菌株)；在115個(gè)VGⅡ基因組中，發(fā)現(xiàn)310 969個(gè)SNP，其中221 248個(gè)簡約SNP；對(duì)太平洋西北地區(qū)爆發(fā)株不同亞型的分析顯示，VGⅡa、VGⅡb和VGⅡc分別僅包含717、246和528個(gè)SNP。進(jìn)一步研究還表明，具有更高毒力的VGⅡa群體來自毒力較弱的譜系，該譜系在MSH2直系同源基因中存在突變，但隨后在VGⅡa株中恢復(fù)，表現(xiàn)出瞬時(shí)突變體表型，可能有助于其適應(yīng)環(huán)境并增加毒力[23]。

5 結(jié)語

格特隱球菌是近年來受到關(guān)注的人類重要的病原性真菌之一，隨著基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，格特隱球菌的基因組學(xué)研究逐漸引起學(xué)術(shù)界關(guān)注?；谛乱淮咄繙y序技術(shù)的全基因組測序，不僅可更好地了解格特隱球菌基因組特征，為基因功能研究提供指導(dǎo)；同時(shí)在格特隱球菌的致病性和防治方面，還可進(jìn)行致病相關(guān)基因鑒定，促進(jìn)疫苗以及新型抗生素的開發(fā)。格特隱球菌的基因組學(xué)研究必將在隱球菌病的防治工作中發(fā)揮重要作用。