方青慧， 劉 歡， 趙桂琴， 文 銅， 王 婷， 孫守江， 許 銘

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州730070)

皮燕麥(AvenasativaL.)和莜麥(AvenanudaL.)均為禾本科燕麥屬(AvenaL.)一年生草本植物，前者籽粒帶稃，為世界廣泛栽培種，主要分布在加拿大，澳大利亞和美國等地，后者外稃易與籽粒分離，稱為裸燕麥，玉麥、鈴鐺麥[1-2]，主要分布在我國東北、華北及西北地區(qū)。燕麥?zhǔn)莾?yōu)質(zhì)高產(chǎn)的糧、飼兼用作物，隨著種草養(yǎng)畜配套技術(shù)的蓬勃發(fā)展，我國燕麥種植面積不斷擴(kuò)大，種子需求量也逐年增加[3-4]。優(yōu)質(zhì)的種子是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，成功地貯藏種子具有重大意義。近年來，高品質(zhì)燕麥籽粒的需求不斷增加，并在食品工業(yè)中得到了積極的應(yīng)用[5]，我國目前種質(zhì)資源保存最普遍的方法是種子貯藏，而國內(nèi)由于牧草種子生產(chǎn)技術(shù)落后，產(chǎn)量低且質(zhì)量差，國產(chǎn)牧草種子的質(zhì)量合格率僅為50%[6-7]。種子從形成、發(fā)育到成熟，再到倉庫貯藏，時(shí)刻受到外界環(huán)境的影響。種子生理成熟時(shí)，活力最高，隨后衰老而走向死亡，相應(yīng)的活力也越來越低，即發(fā)生劣變和老化[8-9]。研究種子劣變過程及相關(guān)機(jī)理，可盡量減少因種子劣變導(dǎo)致質(zhì)量下降所帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

種子活力是決定農(nóng)業(yè)成敗的最基本因素，在老化過程中，線粒體受損，呼吸速率和氧化磷酸化效率降低[10]，這不僅影響種子質(zhì)量，并直接影響種子萌發(fā)與幼苗生長，最終影響植株生長后期的產(chǎn)量與品質(zhì)[11]。種子活力的降低經(jīng)常伴隨著生理生化特性改變，或是植物細(xì)胞中染色體、蛋白質(zhì)和DNA水平的異變，這種現(xiàn)象在脂肪類(油菜BrassicacampestrisL.)、淀粉類(小麥TriticumaestivumL.)和蛋白類(大豆Glycinemax(L.) Merr.)等作物和牧草種子中均有研究[12-15]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者多利用醇溶蛋白標(biāo)記、分子標(biāo)記等遺傳分析手段檢測燕麥種質(zhì)遺傳多樣性，而相關(guān)燕麥老化種子的遺傳完整性研究較少[16-17]。因此，本研究以貯藏不同年限的皮燕麥和莜麥種子為自然老化材料，另外，利用高溫高濕法將種子人工老化，探究皮燕麥和莜麥不同種質(zhì)種子貯藏過程中醇溶蛋白遺傳完整性的變化，進(jìn)一步揭示2種老化方式在種質(zhì)遺傳完整性上的差異，為燕麥耐儲藏性遺傳機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，并為禾本科牧草遺傳完整性的檢測和種子的繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供皮燕麥品種‘隴燕3號’和莜麥品種‘白燕2號’種子。自然老化種質(zhì)材料于2012—2016年收獲，并在常溫倉庫(0℃～10℃，室內(nèi)通風(fēng))貯藏1～5年。

表1 皮燕麥、莜麥的人工老化和自然老化各處理Table 1 Treatments of A. sativa L. and A. nuda L. under artificial aging and natural aging

1.2 人工老化處理

選取2016年秋季收獲的皮燕麥、莜麥種子，測定初始含水量，參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會提供的老化方法[18]，將種子置于高溫、高濕條件下(溫度45℃，相對濕度100%)進(jìn)行人工老化處理。設(shè)定光照培養(yǎng)箱為黑暗24 h，溫度45℃。老化處理時(shí)間分為24 h，48 h，72 h，96 h共4個處理梯度，每個梯度取100 粒燕麥種子，置于培養(yǎng)皿中，保持干燥器內(nèi)相對濕度(Relative Humidity，RH)為100%，以未老化種子為對照(Control Check，CK)。老化完畢后取出種子，晾3～4 d，使種子含水量降至原狀態(tài)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 種子發(fā)芽率測定

取自然老化及人工老化各處理的皮燕麥和莜麥種子放入培養(yǎng)皿，每皿50粒，4次重復(fù)，參照牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程[19]中燕麥標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽條件進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，發(fā)芽床鋪兩層濾紙，每天光照8 h，溫度為25℃，黑暗16 h，溫度為 15℃，第10 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，取平均值。

1.4 燕麥種子醇溶蛋白測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[20]測定燕麥種子醇溶蛋白含量：取10 mL離心管，加入100 uL蒸餾水，5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250作為對照，在若干支試管中依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，100～0 uL蒸餾水(以20 uL為梯度依次遞減)，0～100 uL 0.4 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(以20 uL為梯度依次遞增)，利用分光光度計(jì)測量A595值，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量(ug)為橫坐標(biāo)，吸光度A595為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0046x-0.0376(R2=0.9923)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其醇溶蛋白含量。

1.5 酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳

取自然老化及人工老化皮燕麥和莜麥種子，從不同處理中隨機(jī)取樣30 粒，放入研缽中研磨至粉末狀，加入1 mL 25%2-氯乙醇和5%丙三醇混合體系，室溫下進(jìn)行提取過夜，保存在4℃下備用[21]。使用ISTA(1986)頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid polyacrylamide gel electrophoresis，A-PAGE) (pH=3.2)標(biāo)準(zhǔn)程序(改進(jìn))對處理樣品的醇溶蛋白進(jìn)行電泳分析[22-23]。使用垂直板電泳槽(型號SQ-189)和電泳儀(型號DYY-6D型)，電壓300 V，控制溫度為10℃～15℃，恒壓電泳135 min。5 mL 1%的考馬斯亮藍(lán)及三氯乙酸溶液組成的混合液中固定染色 24 h，沖洗后拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

按照條帶的有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，并觀察蛋白質(zhì)分子的遷移率，把相同遷移率的譜帶視為同一條帶，每一條帶視為一個位點(diǎn)，在Excel 2010中進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用Popgene 32 軟件進(jìn)行遺傳參數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然老化和人工老化下燕麥醇溶蛋白電泳圖譜的變化

根據(jù)皮燕麥和莜麥種子醇溶蛋白PAGE電泳圖(圖1)所示，不同貯藏年限的燕麥種子醇溶蛋白電泳條帶隨著種子貯藏時(shí)間的增長而逐漸模糊。由于貯藏時(shí)間梯度僅為1年間隔，不同處理間差異較小，但貯藏5年與貯藏1年之間的條帶清晰度差異明顯。

圖1中，人工老化96 h(AL5，AB5)和未人工老化種子(AL1，AB1)的醇溶蛋白條帶差異明顯，前者較為模糊且有拖尾現(xiàn)象，可見高溫高濕老化會影響醇溶蛋白的性質(zhì)，使得電泳條帶無法分開，且隨著老化時(shí)間的增加，這種現(xiàn)象愈加明顯。另外，人工老化后燕麥種子ω、γ區(qū)醇溶蛋白的譜帶也發(fā)生了變化，說明種子老化后遺傳完整性的變化與ω、γ區(qū)譜帶有關(guān)。

不同種質(zhì)之間，皮燕麥的電泳條帶數(shù)量明顯多于莜麥。比較而言，莜麥‘白燕2號’的醇溶蛋白PAGE圖譜的變化程度在人工老化和自然老化條件下均較皮燕麥‘隴燕3號’明顯，說明其醇溶蛋白更易發(fā)生劣變，老化速度更快。

圖1不同貯藏年限及人工老化皮燕麥、莜麥醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Gliadin Polyacrylamide gel electrophoresis of A. sativa L. and A. nuda L.in different storage time and artificial aging注：圖中序號見表1Note:Numbers in the figure are shown in table 1

2.2 人工老化及自然老化對燕麥種子醇溶蛋白含量的影響

皮燕麥和莜麥種子中醇溶蛋白的含量隨著貯藏年限的增加而有所降低(圖2)。皮燕麥貯藏4年間(L1～L4)醇溶蛋白含量差異不顯著；貯藏1～3年的莜麥(B1-B3)醇溶蛋白含量差異不顯著，但第4年后出現(xiàn)顯著下降趨勢，其劣變速度加快；尤其是貯藏5年皮燕麥和莜麥種子中醇溶蛋白含量與其他年份種質(zhì)均有顯著性差異(P<0.05)。隴燕3號籽粒中平均醇溶蛋白含量為534.356 ug·g-1，白燕2號為480.784 ug·g-1，皮燕麥的醇溶蛋白含量顯著高于莜麥(P<0.05)。

同樣，隨著人工老化時(shí)間的延長，皮燕麥和莜麥種子的醇溶蛋白含量也在逐漸降低，人工老化的皮燕麥籽粒中平均醇溶蛋白含量為517.054 ug·g-1，莜麥為437.334 ug·g-1。皮燕麥在老化48 h(AL3)后出現(xiàn)明顯下降趨勢；而莜麥在老化24 h(AB2)后下降趨勢明顯。可見，皮燕麥較莜麥醇溶蛋白含量下降較慢，較為耐貯。

圖2 不同貯藏年限及人工老化皮燕麥和莜麥醇溶蛋白含量Fig.2 Content of gliadin of A. sativa L. and A. nuda L.in different storage time and artificial aging注：圖中序號見表1,下同Note:Numbers in the figure are shown in table 1，the same as below

2.3 人工老化與自然老化對燕麥發(fā)芽率的影響

圖3所示，人工老化與自然老化對燕麥發(fā)芽率均有影響，隨著貯藏年限及人工老化時(shí)間的增加，皮燕麥和莜麥的發(fā)芽率均呈下降趨勢，且人工老化后燕麥種子的發(fā)芽率降低程度較自然老化顯著。總體來看，不同貯藏年限下的皮燕麥發(fā)芽率顯著高于莜麥，且貯藏年限對莜麥發(fā)芽率的影響較皮燕麥更加明顯。貯藏1年莜麥發(fā)芽率超過90%，隨后降幅逐年增大，第5年發(fā)芽率降至54%，而貯藏1～5年皮燕麥發(fā)芽率均達(dá)到80%以上。高溫高濕人工老化處理72 h，96 h后的發(fā)芽率與對照組差異顯著(P<0.05)，且人工老化處理對莜麥發(fā)芽率影響大于皮燕麥。

2.4 人工老化與自然老化下燕麥A-PAGE遺傳分析

對人工老化與自然老化皮燕麥和莜麥A-PAGE進(jìn)行遺傳分析(表2)，共檢測到41個等位位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有37個，每個位點(diǎn)平均等位基因?yàn)?.902，平均Nei’s信息指數(shù)為0.360，平均Shannon信息指數(shù)(I)為0.523。自然老化下皮燕麥和莜麥擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶比例分別為70%，64.865%；人工老化條件下皮燕麥和莜麥的多態(tài)性條帶比例為59.459%，57.143%。顯然，人工老化后皮燕麥以及莜麥的多態(tài)性降低明顯。

本研究利用Popgen 32軟件中各遺傳參數(shù)分別估計(jì)了自然老化和人工老化各群體的遺傳變異。與自然老化相比較，人工老化燕麥種子的Na，Ne，H，I這4 個指標(biāo)都有所下降(表3)，由此表明，人工老化更易于破壞燕麥種質(zhì)資源遺傳完整性。自然老化條件下，皮燕麥H值為0.215±0.221，I值為0.313±0.312，莜麥H和I 值分別為0.191±0.212，0.280±0.305?？梢姡ぱ帑湹倪z傳多樣性稍高于莜麥。

遺傳相似性分析(附表4)表明，隨著貯藏年限的增加，皮燕麥和莜麥的遺傳相似性逐年降低，種子貯藏年限相隔越遠(yuǎn)，其相似性系數(shù)越小。各種老化處理燕麥種子的平均相似性系數(shù)為0.637，自然老化下皮燕麥遺傳相似系數(shù)在0.976～0.781間，莜麥為0.927～0.732；人工老化各處理皮燕麥遺傳相似系數(shù)為0.951～0.732；莜麥為0.902～0.707。

圖3 人工老化與自然老化下皮燕麥和莜麥的發(fā)芽率Fig.3 Germination rate of A. sativa L. and A. nuda L. in artificial aging and natural aging treatments

表2 人工老化與自然老化皮燕麥、莜麥A-PAGE分析的遺傳變異Table 2 Genetic variation of artificial aging and natural aging in A. sativa L. and A. nuda L. based on A-PAGE analysis

群體 Population多態(tài)性位點(diǎn)數(shù) K多態(tài)性等位基因數(shù) Np多態(tài)性條帶比例數(shù) PPB/%L142870B122464.865AL112259.459AB102057.143

注：L，B分別表示自然老化下的皮燕麥、莜麥群體；AL，AB分別表示人工老化下的皮燕麥、莜麥群體。下同

Note:L and B representA.sativaL. andA.nudaL. under natural aging,respectively;AL and AB representA.sativaL. andA.nudaL. under artificial aging,respectively.The same as below

表3 人工老化與自然老化皮燕麥和莜麥的遺傳參數(shù)分析Table 3 Genetic parameters analysis of A. sativa L. and A. nuda L. in artificial aging and natural aging treatments

3 討論

3.1 自然老化與人工老化對皮燕麥和莜麥種子遺傳完整性的影響

當(dāng)前種質(zhì)保存工作的核心是維持種質(zhì)的遺傳完整性，即維持種質(zhì)在貯藏及繁殖更新過程中最低程度的遺傳改變，保持群體的基因頻率分布、等位基因頻率分布的穩(wěn)定及遺傳結(jié)構(gòu)的完整[12,16]。本研究對2012—2016年收獲貯藏的皮燕麥和莜麥遺傳完整性探究，醇溶蛋白圖譜顯示隨著燕麥種子貯藏時(shí)間和人工老化時(shí)間的增加，電泳條帶趨于模糊，并伴有條帶消失，表明A-PAGE方法可以顯示老化燕麥籽粒中醇溶蛋白的變化。人工老化使得燕麥種質(zhì)醇溶蛋白條帶不能完全分開且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。尤其是人工老化96 h后皮燕麥和莜麥種子醇溶蛋白條帶均極為模糊，說明此條件下燕麥種子老化程度過高，因此建議高溫高濕人工老化燕麥種子條件應(yīng)低于96 h。與測定的醇溶蛋白含量相結(jié)合，共同表明自然老化條件下皮燕麥和莜麥種子醇溶蛋白含量有明顯下降，尤其是在貯藏5年后，下降趨勢顯著。譚富娟等[24]利用種子活力測定的方法發(fā)現(xiàn)長期貯存的燕麥種子生活力會逐漸降低，遺傳完整性會遭受破壞。王小麗[26]對扁蓿豆(MedicagoruthenicaTrautv)種質(zhì)資源遺傳完整性的研究也有相似結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)貯藏4年內(nèi)的燕麥籽粒A-PAGE的條帶數(shù)目變化并不十分明顯，這可能是由于燕麥屬于自交植物，楊苗苗等[9]指出裸燕麥種子老化處理研究適宜的樣本量是50～70株，而本研究中30個取樣群體數(shù)量相對較少；另外，同種燕麥種質(zhì)中編碼醇溶蛋白的基因相同，聚丙烯酰胺凝膠電泳與其他分子標(biāo)記相比，反映的條帶數(shù)較少，無法表現(xiàn)種質(zhì)細(xì)微差異；但是A-PAGE方法操作簡單，無需進(jìn)行DNA提取和PCR操作，同樣能檢測出不同種質(zhì)之間的多態(tài)性水平，結(jié)果穩(wěn)定可靠，因此仍可用于燕麥種子劣變老化研究。

種子劣變老化遺傳完整性研究還要結(jié)合遺傳學(xué)等學(xué)科，對其遺傳參數(shù)進(jìn)行分析研究。與自然老化相比較，人工老化皮燕麥和莜麥種子的Ne，H，I，PPB等遺傳參數(shù)均有下降。宿宇等[27]、王欣欣等[28]利用醇溶蛋白及分子標(biāo)記的方法對老芒麥(ElymussibiricusL.)、扁蓿豆種子遺傳完整性研究也有同樣發(fā)現(xiàn)，即人工老化后種子的遺傳多樣性水平有所下降，進(jìn)一步說明人工老化對燕麥種子遺傳完整性的破壞更加顯著。在種子老化過程中，種子活力逐漸降低，一些醇溶蛋白編碼基因的DNA序列順序改變或者丟失，對其遺傳完整性維持產(chǎn)生不利影響，使得其遺傳多樣性指數(shù)逐漸降低，本研究中皮燕麥、莜麥的相似性系數(shù)逐漸降低，而且老化時(shí)間越長，其相似性系數(shù)越低。相關(guān)大豆[12]、老芒麥[28]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[35]種質(zhì)種子遺傳完整性的研究結(jié)果均驗(yàn)證了這一點(diǎn)。此外，皮燕麥和莜麥各種老化處理的平均相似性系數(shù)為0.637，進(jìn)一步說明皮燕麥與莜麥不同種質(zhì)之間的遺傳差異。

3.2 自然老化與人工老化對皮燕麥、莜麥種子發(fā)芽率的影響

發(fā)芽率測定進(jìn)一步驗(yàn)證了劣變對燕麥種子活力及質(zhì)量的影響[29]。本試驗(yàn)中隨著種子貯藏年限的增加，皮燕麥和莜麥種子的發(fā)芽率均呈下降趨勢，且人工老化較自然老化對種子發(fā)芽率的影響更加顯著，發(fā)芽率變化趨勢與PAGE醇溶蛋白結(jié)果相互應(yīng)證。任守杰等[25]利用醇溶蛋白電泳技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同繁殖年份的20份小麥種質(zhì)更新時(shí)較高的發(fā)芽率是維持異質(zhì)性種質(zhì)遺傳完整性的關(guān)鍵因素。孔治有等[30]、王玉嬌等[31]、Manuela等[32]同樣發(fā)現(xiàn)小麥、大麥(HordeumvulgareL.)種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均隨著老化處理時(shí)間的延長而呈顯著下降趨勢?？梢娫诜N子貯藏過程中，種子發(fā)生老化而引起種子的質(zhì)量發(fā)生劣變是不可避免的[33]，最終影響種質(zhì)資源的保存、開發(fā)及其利用[34]。

附表4 皮燕麥和莜麥種質(zhì)在人工老化及自然老化不同處理下醇溶蛋白相似性系數(shù)Attached list 4 The similarity coefficient of gliadin under different treatments of artificial aging and natural aging oat germplasm

3.3 自然老化與人工老化對皮燕麥、莜麥不同種質(zhì)的影響

自然老化和人工老化對于不同種質(zhì)皮燕麥和莜麥種子的遺傳完整性均有一定影響。而且莜麥的劣變程度要高于皮燕麥，其最佳貯藏年限要低于皮燕麥，這可能是由于兩者具有不同的形態(tài)、性狀表現(xiàn)[36]及遺傳結(jié)構(gòu)的差異，皮燕麥通常具有較為堅(jiān)硬稃皮保護(hù)，而裸燕麥外稃質(zhì)薄，收種時(shí)籽實(shí)與稃皮自然脫離，另外，不同種質(zhì)籽粒中醇溶蛋白、谷蛋白等貯藏營養(yǎng)物質(zhì)的差異也會導(dǎo)致劣變程度的不同。皮燕麥和莜麥不同種間的醇溶蛋白含量及A-PAGE遺傳變異分析結(jié)果表現(xiàn)出一定差異，條帶及組合方式完全受基因控制，醇溶蛋白具有高度異質(zhì)性和復(fù)雜性，受環(huán)境影響很小[22]。種質(zhì)遺傳完整性還與種子老化、繁殖群體量、收獲方式和繁殖地點(diǎn)等因素密切相關(guān)。因此，應(yīng)詳細(xì)了解應(yīng)試種子的遺傳背景，同時(shí)與形態(tài)學(xué)、生理生化、細(xì)胞學(xué)、DNA分子標(biāo)記技術(shù)等結(jié)合起來，進(jìn)行全面綜合分析，才能準(zhǔn)確的反映種子老化對其遺傳完整性的影響。

4 結(jié)論

本研究利用A-PAGE對老化條件下燕麥遺傳完整性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)隨著燕麥種子老化程度的加深，種子中醇溶蛋白含量及種子發(fā)芽率逐漸降低，A-PAGE方法顯示老化燕麥籽粒中醇溶蛋白電泳條帶明顯減少和變?nèi)?，遺傳多樣性降低，遺傳變異頻率降低，遺傳完整性在一定程度上被破壞。高溫高濕人工老化對燕麥種子的影響比5年內(nèi)自然老化更加明顯。貯藏1～3年及人工老化0～48 h的皮燕麥和莜麥種子仍可保持較高的遺傳多樣性及發(fā)芽率，且各遺傳參數(shù)差異不明顯，所以，燕麥種子的適宜貯藏年限應(yīng)保持在1～3年，而不宜超過5年。不同種質(zhì)之間，莜麥的老化速度在人工老化和自然老化條件下均高于皮燕麥。