SP600125阻斷JNK信號(hào)通路下電針對(duì)慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激大鼠HPA軸的影響*

李亞歡，梁星辰，姜會(huì)梨，趙冰驄，孫 陽(yáng)，高興州，李 想，馮世醒，李宇飛，圖 婭

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

抑郁癥是臨床常見(jiàn)精神障礙類(lèi)疾病，臨床癥狀涉及廣泛，其癥狀的主要特征是情緒障礙、快感缺乏、認(rèn)知功能障礙或復(fù)發(fā)易感性增加[1]。研究表明，抑郁癥發(fā)病與應(yīng)激密切相關(guān)[2]。應(yīng)激可以激活JNK信號(hào)通路，引起下丘腦-垂體-腎上腺素軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能亢進(jìn)，損傷海馬組織[3]，導(dǎo)致抑郁樣行為。由于抑郁癥發(fā)病機(jī)制不明確，傳統(tǒng)抗抑郁藥物治療手段有限，且存在無(wú)應(yīng)答、副作用大的特點(diǎn)，因此迫切需要新的治療手段。研究顯示，針灸治療抑郁癥療效肯定[4-6]，但針刺是否通過(guò)JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)HPA軸發(fā)揮抗抑郁作用還需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)將觀察當(dāng)JNK信號(hào)通路被其特異性阻斷劑SP600125阻斷后，電針對(duì)慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激(CUMS)模型大鼠行為學(xué)的影響和對(duì)HPA軸相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，探究電針及氟西汀治療CUMS大鼠的異同，進(jìn)一步探討電針抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，7周齡，160～200 g[北京維通利華，SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自購(gòu)入后，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)的清潔級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，群養(yǎng)，自由攝食飲水，晝夜交替光照，溫度18～25℃，濕度(55±2)%。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有操作均在以減少、替代和優(yōu)化為核心的“3R”原則的指導(dǎo)下進(jìn)行，善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，維護(hù)動(dòng)物福利。

1.2 主要儀器與試劑

無(wú)菌針灸針(規(guī)格：0.20 mm×25 mm，蘇州環(huán)球牌);腦立體定位儀(美國(guó)Stoelting);電針儀(北京華衛(wèi)，型號(hào)：HANSLH-202)；鹽酸氟西汀(美國(guó)禮來(lái));SP600125阻斷劑(美國(guó)Selleck);二甲基亞砜(DMSO);大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA檢測(cè)試劑盒、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒、大鼠皮質(zhì)酮(CORT)ELISA試劑盒(20160219，BG)。

1.3 分組及干預(yù)方法

72只SD大鼠隨機(jī)分為8組:空白組、模型組、氟西汀組、電針組、溶劑組、阻斷劑組、氟西汀+阻斷劑組、電針+阻斷劑組。除空白組大鼠群養(yǎng)、自由攝食飲水外，其余組均1只/籠孤養(yǎng)，且每日隨機(jī)給予1種刺激方法。氟西汀組和氟西汀+阻斷劑組，于每日應(yīng)激前30 min氟西汀灌胃。電針組和電針+阻斷劑組，每日應(yīng)激前30 min電針干預(yù)。溶劑組，于應(yīng)激前1 h給予與阻斷劑溶液同等劑量的DMSO側(cè)腦室注射，劑量10 μL/d。阻斷劑組、氟西汀+阻斷劑組和電針+阻斷劑組，于應(yīng)激前1 h給予DMSO配制的阻斷劑溶液進(jìn)行側(cè)腦室注射，劑量10 μL/d。

針刺方法:根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期研究，參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》，選取相當(dāng)于人體解剖部位的“內(nèi)關(guān)”和“三陰交”兩穴，內(nèi)關(guān)穴直刺，深度3～5 mm,三陰交穴直刺3～5 mm，接電針2 Hz、0.6 mA，以局部微顫為宜，20 min/次，1次/日，持續(xù)21天。

陽(yáng)性藥物給藥方法:0.2 mg/mL的氟西汀混懸液，灌胃給藥，1.8 mg/kg，1次/日，持續(xù)21天。

1.4 模型制備

本實(shí)驗(yàn)的造模方法為常用的CUMS法[1,7]，操作方法：使用7種不可預(yù)知的溫和性刺激(包括：夾尾3 min、震蕩30 min、束縛2 h、夜間光照12 h、斷食24 h、斷水24 h和潮濕墊料24 h)持續(xù)刺激21天，平均每種刺激使用3次，每日的刺激不應(yīng)在同一時(shí)間段進(jìn)行，避免大鼠產(chǎn)生耐受性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1周，溶劑組、阻斷劑組、氟西汀+阻斷劑組、電針+阻斷劑組大鼠均行側(cè)腦室套管埋置術(shù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意保持室內(nèi)整潔、安靜，溫度、濕度適宜，盡量減少空氣流動(dòng)，實(shí)驗(yàn)人員操作力度適當(dāng)，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 側(cè)腦室套管埋置及給藥方法

根據(jù)文獻(xiàn)所示操作方法[1]，采取腹腔注射法，注射10%的水合氯醛麻醉大鼠。待大鼠倒下，全身無(wú)力，反應(yīng)消失后，將其放置于腦立體定位儀上，固定，保持大鼠顱骨水平位置，尋找前囟點(diǎn)。用定位儀確定大鼠側(cè)腦室的具體位置(旁開(kāi)約1.5 mm，前囟后0.9 mm)，迅速標(biāo)記，鉆孔，植入套管，固定周?chē)M織。注射套管保持被套管帽覆蓋狀態(tài)，僅在注射藥物時(shí)開(kāi)啟。術(shù)后恢復(fù)7天。

根據(jù)計(jì)算，將適量的SP600125倒入DMSO溶液中，配制成濃度10 mg/mL的SP600125阻斷劑溶液，實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，每?jī)扇兆⑸?次，左右交替進(jìn)行，劑量10 μL/d，持續(xù)21天。DSMO溶液，實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始每?jī)扇兆⑸?次，左右交替進(jìn)行，劑量10 μL/d，持續(xù)21天。

1.6 糖水實(shí)驗(yàn)

本研究采用糖水實(shí)驗(yàn)反映大鼠快感缺乏的抑郁樣行為。于實(shí)驗(yàn)前2天，對(duì)大鼠進(jìn)行1%糖水適應(yīng)性訓(xùn)練，隨后禁食12 h。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1天，實(shí)驗(yàn)第7天、14天和21天的同一時(shí)間段，以同樣方法測(cè)量大鼠1 h的糖水消耗量，共4次，計(jì)算糖水偏好指數(shù)，對(duì)比大鼠糖水偏好指數(shù)變化。計(jì)算方法：糖水偏好指數(shù)(100%)=糖水?dāng)z入量/總液體攝入量×100%。

1.7 ELISA法檢測(cè)大鼠下丘腦CRH和垂體ACTH含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用抽簽法從每組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉，冰上快速分離垂體與下丘腦，置于液氮中，轉(zhuǎn)移到冰箱保存(溫度：-80℃)，等待檢測(cè)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)(ELISA法,反相競(jìng)爭(zhēng)法)檢測(cè)大鼠下丘腦CRH和垂體ACTH含量。檢測(cè)方法按照ELISA試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 ELISA法檢測(cè)大鼠血清ACTH和CORT含量

實(shí)驗(yàn)完成后，隨機(jī)從每組中抽取6只大鼠，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，血樣置于10 mL離心管，靜置1 h(室溫)，離心20 min(r=3 000 r/min)，取上清液，分裝于1.5EP管中，于低溫冰箱中冷凍保存，溫度：-80℃。用ELISA法檢測(cè)大鼠血清ACTH和CORT含量。具體檢測(cè)方法參照ELISA試劑盒操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 糖水偏好指數(shù)結(jié)果

相對(duì)于模型組而言，氟西汀+阻斷劑組的大鼠糖水偏好百分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.01)；與氟西汀組相比，電針組大鼠明顯升高(P<0.05)；與溶劑組相比，電針組大鼠糖水?dāng)z入量升高(P<0.01)。見(jiàn)表1和封三彩圖1。

表1 各組大鼠糖水偏好指數(shù)

注：組間差異(F=2.904，P=0.011)；組內(nèi)差異：測(cè)量時(shí)間(F=7.043，P=0.000)；組別×測(cè)量時(shí)間(F=0.514，P=0.962);與模型組相比，##P<0.01；與溶劑組相比，▲▲P<0.01；與氟西汀組相比，■P<0.05。

2.2 各組大鼠垂體ACTH和下丘腦CRH含量變化

與空白組相比，模型組垂體促腎上腺皮質(zhì)激素表達(dá)顯著增加(P<0.01)；相對(duì)于模型組而言，氟西汀組大鼠的垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量顯著降低(P<0.01)，電針組大鼠的垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量顯著降低(P<0.01)；與溶劑組相比，阻斷劑組明顯降低(P<0.05)，氟西汀+阻斷劑組顯著降低(P<0.05)，電針+阻斷劑組大鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平顯著降低(P<0.01)；與阻斷劑組相比，電針+阻斷劑組的垂體促腎上腺皮質(zhì)激素含量顯著降低(P<0.05)；與氟西汀+阻斷劑組相比，電針+阻斷劑組垂體促腎上腺皮質(zhì)激素含量顯著降低(P<0.05)。各組大鼠下丘腦CRH表達(dá)干預(yù)前后無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組大鼠垂體ACTH和下丘腦CRH含量變化

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與溶劑組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與阻斷劑組比較，■P<0.05；與氟西汀組比較，◆P<0.05；與氟西汀+阻斷劑組比較，◇P<0.05。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與溶劑組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與阻斷劑組比較，■P<0.05；與氟西汀組比較，◆P<0.05；與氟西汀+阻斷劑組比較，◇P<0.05。圖2 各組大鼠垂體ACTH和下丘腦CRH含量變化

2.3 各組大鼠血清ACTH和CORT含量變化

與空白組相比，模型組血清ACTH表達(dá)顯著增加(P<0.05)；相比于模型組，氟西汀組大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)顯著降低(P<0.01)，電針組血清促腎上腺皮質(zhì)激素顯著降低(P<0.05)；與溶劑組相比，電針+阻斷劑組血清的促腎上腺皮質(zhì)激素水平降低(P<0.05)；相比于阻斷劑組，電針+阻斷劑組血清的促腎上腺皮質(zhì)激素含量降低(P<0.05)。

與空白組相比，模型組血清CORT表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組血清CORT降低(P<0.01),電針組血清的CORT含量也有降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清ACTH和CORT含量變化

注：血清ACTH組間差異(F=3.528，P=0.005);血清CORT組間差異(F=2.335,P=0.043)。與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與溶劑組比較，▲P<0.05；與阻斷劑組比較，■P<0.05;血清CORT組間差異(F=2.335，P=0.043)。

3 討論

抑郁癥是一種情緒低落、興趣喪失以及精力缺乏為主癥的臨床常見(jiàn)精神疾患，是全球疾病負(fù)擔(dān)的重要貢獻(xiàn)者，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域備受關(guān)注[8]。2019年2月18日，北京大學(xué)第六醫(yī)院黃悅勤教授等在《柳葉刀·精神病學(xué)》發(fā)表研究文章，報(bào)告了中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查(CMHS)的患病率數(shù)據(jù)：樣本來(lái)自中國(guó)除港澳臺(tái)地區(qū)的31個(gè)省、自治區(qū)及直轄市，157個(gè)國(guó)家CDC疾病監(jiān)測(cè)點(diǎn)(縣/區(qū))，共32 552人完成了調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)，排除癡呆后，六大類(lèi)精神障礙(心境障礙、焦慮障礙、酒精/藥物使用障礙、精神分裂癥及相關(guān)精神病性障礙、進(jìn)食障礙、沖動(dòng)控制障礙)的加權(quán)12月患病率為9.3%(95% CI 5.4-13.3)，加權(quán)終生患病率為16.6%(13.0-20.2)。抑郁癥發(fā)病復(fù)雜，與社會(huì)環(huán)境、生化、遺傳等因素密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥發(fā)病與區(qū)域腦容量變化(尤其是海馬區(qū))及功能性大腦環(huán)路(如認(rèn)知控制網(wǎng)絡(luò))改變關(guān)系密切。抑郁癥的病理機(jī)制過(guò)程中有確切的神經(jīng)生物學(xué)應(yīng)答系統(tǒng)功能紊亂，包括 HPA軸功能紊亂和免疫系統(tǒng)紊亂。

應(yīng)激是在內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到威脅時(shí)，機(jī)體為了保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡而產(chǎn)生的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。一定程度的應(yīng)激能激活機(jī)體非特異適應(yīng)系統(tǒng)，提高抵抗力，但是嚴(yán)重或持久的應(yīng)激則對(duì)身體無(wú)益，尤其是慢性應(yīng)激。慢性應(yīng)激嚴(yán)重影響著人類(lèi)的身心健康，容易誘發(fā)軀體或精神疾病[9]，導(dǎo)致抑癥的發(fā)生，誘發(fā)抑郁樣行為。糖水實(shí)驗(yàn)可以基于獎(jiǎng)賞系統(tǒng)評(píng)價(jià)抑郁癥模型快感缺乏程度。本實(shí)驗(yàn)采用糖水偏好指數(shù)作為行為學(xué)觀察指標(biāo)，觀察大鼠快感缺失的抑郁樣行為。研究結(jié)果顯示，慢性不可預(yù)知應(yīng)激誘導(dǎo)模型組大鼠糖水偏好指數(shù)顯著降低，是大鼠對(duì)糖水獎(jiǎng)賞的敏感性降低的結(jié)果，是快感缺乏程度加重的表現(xiàn)，這與先前研究具有一致性[10]。針刺干預(yù)有效逆轉(zhuǎn)了大鼠糖水偏好指數(shù)降低,明顯改善了大鼠抑郁樣行為。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)的基線行為學(xué)數(shù)據(jù)存在組間差異，這可能是由于經(jīng)側(cè)腦室套管埋置術(shù)組別經(jīng)過(guò)手術(shù)刺激的干擾所致。其潛在原因和機(jī)制，本團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行深入研究。

HPA軸功能亢進(jìn)，是抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制之一[11-12]。隨著刺激的持續(xù)，下丘腦釋放大量CRH，刺激垂體合成、釋放大量的促腎上腺皮質(zhì)激素，外周血促腎上腺皮質(zhì)激素水平增加，作用于腎上腺皮質(zhì)，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)和外周血的皮質(zhì)醇(CORT)含量均上升。針刺可調(diào)節(jié)HPA軸功能狀態(tài)，緩解亢進(jìn)狀態(tài)，下調(diào)ACTH、CORT水平，糾正HPA軸紊亂，從而起到抗抑郁的作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，電針在下調(diào)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠HPA軸上關(guān)鍵性指標(biāo)ACTH及CORT的表達(dá)及減輕抑郁癥狀上有穩(wěn)固效果[13-14]。電針結(jié)合氟西汀干預(yù)慢性應(yīng)激模型大鼠的研究表明，電針治療在逆轉(zhuǎn)HPA軸高功能狀態(tài)方面，有著與氟西汀相當(dāng)?shù)寞熜15]，但是，電針結(jié)合氟西汀的治療卻比兩者單用效果顯著，提示電針有與氟西汀相當(dāng)水平的抗抑郁作用，并與氟西汀具有協(xié)同抗抑郁作用。

c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)即為應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)，能激活Ser63和Ser73兩個(gè)c-jun氨基末端區(qū)域，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的主要成分，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，從而廣泛牽涉多種疾病的發(fā)生演變，且發(fā)揮重要作用[16-19]。MAPK家族是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)各種外部刺激信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部，參與調(diào)節(jié)多種重要的生理過(guò)程。JNK的激活常見(jiàn)于各種神經(jīng)退化性疾病當(dāng)中，近年的研究成果已逐漸證實(shí)JNK的激活在抑郁行為調(diào)控中的重要作用。JNK信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是級(jí)聯(lián)反應(yīng)。MKK4和MKK7可以磷酸化JNK信號(hào)通路上的兩個(gè)位點(diǎn)而激活JNK信號(hào)通路，引發(fā)活化的JNK中的一部分從核外向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，繼而激活新蛋白質(zhì)的合成途徑，發(fā)揮效應(yīng)。JNK/MAPK可以通過(guò)加速c-jun磷酸化和激活Caspase家族的凋亡蛋白兩種途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，本實(shí)驗(yàn)中采用的應(yīng)激方法成功激活了大鼠海馬的JNK信號(hào)通路，影響了HPA軸上關(guān)鍵性指標(biāo)含量，導(dǎo)致ACTH、CORT和CRH含量水平升高，致使出現(xiàn)抑郁樣行為，與前期研究結(jié)果一致[22-29]。JNK信號(hào)通路特異性阻斷劑SP600125能特異性地阻斷JNK信號(hào)通路，且具有高度特異性，能明顯降低JNK信號(hào)通路的活性，且其作用強(qiáng)度比MAPK激酶ERK1、p38-2和絲/蘇氨酸激酶PKA更高。研究顯示，阻斷劑SP600125與電針共用和與氟西汀共用時(shí)，均能產(chǎn)生較單用電針和氟西汀更好的療效，SP600125能夠減少c-jun的磷酸化[30]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，電針可調(diào)控JNK信號(hào)通路的活性，下調(diào)ACTH、CORT和CRH水平，從而改善抑郁樣行為，且與阻斷劑同用具有協(xié)同作用，治療效果更顯著。與前期研究具有一致性。

根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期研究，本研究選取了“內(nèi)關(guān)”和“三陰交”兩穴。內(nèi)關(guān)，為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，能安神定悸，“心澹澹而善驚恐心悲，內(nèi)關(guān)主之”；同時(shí)，內(nèi)關(guān)通陰維脈，為“八脈交會(huì)穴”之一，精神疾病的發(fā)生多與陰維脈功能失調(diào)有關(guān)，“陰陽(yáng)不能自相維，則悵然失志”。三陰交為足三陰經(jīng)之交會(huì)穴，能健脾、疏肝、益腎、調(diào)和氣血，兩穴共用能疏肝解郁、鎮(zhèn)靜安神。董佩等[31]分析研究針刺治療原發(fā)性抑郁癥的選穴規(guī)律，發(fā)現(xiàn)：內(nèi)關(guān)、三陰交是臨床針刺治療抑郁癥中使用頻率僅次于百會(huì)、印堂的穴位。馬學(xué)紅等[32]在針刺聯(lián)合西藥治療抑郁癥的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)、三陰交等穴，可以明顯降低輕中度抑郁癥患者的漢密爾頓量表(HAMD-17)和基于患者報(bào)告的癥狀量表(MYMOP)得分，緩解抑郁狀態(tài)，改善患者總體健康狀況和活動(dòng)情況，且治療效果優(yōu)于單純的西藥治療。

總之，針刺治療對(duì)于緩解抑郁癥患者的軀體障礙、情感障礙和認(rèn)知障礙的療效已經(jīng)被證實(shí)，且治療優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，不會(huì)產(chǎn)生抗抑郁藥常見(jiàn)的副作用[33-35]?？梢?jiàn)，進(jìn)一步深入探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制及針刺抗抑郁機(jī)理的必要性。本研究結(jié)果具有啟發(fā)性，電針對(duì)慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁狀態(tài)的治療作用可能是通過(guò)干預(yù)JNK信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)HPA軸功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，通過(guò)探究其在細(xì)胞和分子水平可能的發(fā)病機(jī)制將為尋找更有效的抗抑郁防治方法的重要途徑，可能對(duì)于揭秘針刺抗抑郁機(jī)制意義非凡，因此本研究團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)一步深入研究中。