紫外分光光度法測定大棗中總黃酮的研究

李蓮芳 楊麗莉 龍艷昆 李娟

摘要：目的 建立大棗中總黃酮含量的測定方法。方法 以蘆丁為對照品，在275nm波長下測定總黃酮在三氯化鋁甲醇溶液中的吸光度，計算大棗中總黃酮的含量。結(jié)果 大棗中總黃酮含量為0.41%。結(jié)論 方法簡便易行，適用于大棗中總黃酮含量的測定。

關(guān)鍵詞：大棗;總黃酮;紫外分光光度法

中圖分類號：R914?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2019）08-0075-03

大棗為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實，為常用中藥之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。味甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)。為補中益氣、養(yǎng)血安神、緩和藥性的常用中藥，用于脾虛食少、乏力便溏、婦人臟躁等，國內(nèi)外應(yīng)用前景廣闊。黃酮類化合物是大棗的化學成分之一，大棗中富含多種黃酮，如蘆丁、槲皮素、當藥黃素等，這些黃酮類化合物對血管有舒張作用，能拮抗血小板活化因子作用，可清除自由基，抑制生物膜上不飽合脂肪酸的過氧化而具有抗氧化作用，同時可延長戊巴比妥干預睡眠時間起到鎮(zhèn)靜作用[1]。目前，根據(jù)文獻報道[2]，測定大棗中總黃酮的含量主要采用的方法

是比色法，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，此方法測試前的測試液有紅色絮狀沉淀，我們將其過濾，其吸光度大大減小，因此，筆者認為，比色法不適宜用于大棗中總黃酮的含量測定。本文的目的是建立紫外分光光度法測定大棗中總黃酮含量的方法。

1 方法理論依據(jù)

黃酮廣泛存在于許多植物的莖、葉和果實中，其基本結(jié)構(gòu)是2-苯基色原酮，母核上常有-OH、-OCH3等取代基，并常以苷的形式存在。大棗中的黃酮主要是蘆丁、當藥黃素等。其化學結(jié)構(gòu)如下：

在下述結(jié)構(gòu)中，黃酮母核上所含的游離羥基能與鋁鹽形成絡(luò)合物[3]。

此絡(luò)合物在紫外區(qū)有特征吸收峰，可用于測定黃酮含量。以蘆丁為例，蘆丁與AlCl3反應(yīng)形成絡(luò)合物的特征吸收峰圖譜見圖1。

2 實驗部分

2.1 儀器與試藥

2.1.1 材料與試藥 大棗由云南金發(fā)藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)該公司質(zhì)量部門鑒定為大棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實;蘆丁對照品（批號：HL-180122，純度≧98%，購自昆明市官渡區(qū)卓達儀表儀器經(jīng)營部）;蒸餾水;實驗所用的其它試劑均為分析純，購自昆明市官渡區(qū)卓達儀表儀器經(jīng)營部。

2.1.2 儀器 紫外可見分光光度計（型號：UV-1800PC-DS，上海美諾達儀器有限公司）;天子分析天平（型號：LAC-224C，常熟市夢蘭百靈天平儀器有限公司）;水浴鍋（型號：DK-98-IIA）;回流提取裝置。

3 方法與結(jié)果

3.1 樣品溶液制備 取大棗藥材（60℃條件下干燥7h），粉碎，取大棗粉末約1 g，加60%乙醇20 mL，稱定重量，回流提取2 h，密塞冷卻，用60%乙醇補足減失的重量，水浴鍋上加熱，趁熱過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

3.2 大棗黃酮和蘆丁的吸收光譜特性 取4個25 mL容量瓶，1、2號各加入1 mL大棗黃酮樣品溶液，3、4號各加1 mL蘆丁標準溶液（0.248 mg/mL），在2、4號各加入1 mL 2% AlCl3溶液，搖勻，4個容量瓶都用甲醇定容，混勻后放置30分鐘，分別置于1 cm石英比色皿中，1、3號以甲醇作為空白溶液，2、4號以1 mL 2% AlCl3溶液同法制備空白溶液，用紫外-可見分光光度計在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行全程掃描。吸收峰圖譜見圖2。

從圖2可見，在紫外區(qū)，在甲醇溶液中，蘆丁的最大吸收波長為258 nm，大棗總黃酮最大吸收波長為260 nm;在三氯化鋁甲醇溶液中，蘆丁的最大吸收波長為275 nm，大棗總黃酮的最大吸收波長為270 nm。三氯化鋁的存在使大棗總黃酮和蘆丁的吸收峰都發(fā)生了紅移，最大吸收峰幾乎重合，從圖譜上看，大棗總黃酮的波峰沒有蘆丁的波峰尖，經(jīng)過對大棗總黃酮波峰附近的吸收度進行對比，在270～275 nm區(qū)間的吸光度差別不大，差別在0.005～0.001之間，因此，可以以蘆丁為標準在275 nm測定大棗總黃酮含量。

3.3 測定條件的確定

3.3.1 三氯化鋁溶液用量的確定 為了確定2% AlCl3的最佳用量，取大棗黃酮樣品溶液和蘆丁標準溶液各1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按以下2% AlCl3的量分別加入，搖勻，用甲醇定容，放置30 min，在紫外-可見分光光度計上測定了不同AlCl3用量時，大棗總黃酮和蘆丁的吸光度，測定結(jié)果見表1。

從表1可見，隨著2% AlCl3溶液用量的增加，吸光度趨于增大，但用量超過0.5 mL后，吸光度變化不大，但蘆丁吸光度隨著AlCl3用量的增加有少量增大的趨勢，這可能跟蘆丁與AlCl3反應(yīng)后有顯色吸收有關(guān)系，為了能使樣品中的黃酮類化合物反應(yīng)充分，我們將2% AlCl3的用量定為1 mL。

3.3.2 反應(yīng)時間與穩(wěn)定性的確定 取大棗黃酮樣品溶液1 mL，蘆丁標準溶液1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加入1 mL 2% AlCl3溶液，甲醇定容后放置不同時間，在紫外-可見分光光度計上測定吸光度，測定結(jié)果見表2。

從表2可見，反應(yīng)液放置20～30 min，吸光度已經(jīng)基本穩(wěn)定，在60 min內(nèi)變化很小，據(jù)此確定反應(yīng)時間為30 min。

3.4 樣品測定方法

3.4.1 標準溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品10 mg，用甲醇溶解，甲醇定容于50 mL容量瓶中。

3.4.2 標準曲線的建立 分別取0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mL標準溶液于25 mL容量瓶中，各加2%AlCl3溶液1 mL，搖勻，用甲醇定容，混勻后放置30min，以不加標準品溶液同法制備空白溶液，測定吸光度值。記錄標準溶液測定項下系列標準溶液的吸光度值，以濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為Y=0.0417X+0.0027，r=0.9999。結(jié)果表明，蘆丁檢測濃度在4.96～19.84 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3.4.3 大棗中總黃酮的測定 按照3.1項的操作制備大棗樣品溶液，精密吸取大棗樣品溶液1 mL，于25 mL容量瓶中，按照標準曲線項下方法操作，測定吸光度，由回歸方程求出稀釋液中總黃酮濃度，然后計算大棗藥材中總黃酮的百分含量。

3.5 方法學考察 分別考察紫外可見分光光度法測定大棗總黃酮方法的精密度、重復性和加樣回收率。

3.5.1 精密度考察 精密量取蘆丁標準品溶液5份，各1 mL，按照標準曲線項下操作平行測定吸光度，計算RSD值為0.41%（n=5），說明精密度、準確度良好，測定結(jié)果見表3。

3.5.2 重現(xiàn)性考察 取同一批次大棗樣品5份，按照3.1項的操作制備大棗樣品溶液，按照3.4.3 項下測定大棗中總黃酮含量，計算RSD值為3.23%（n=5），說明重現(xiàn)性良好，測定結(jié)果見表4。

3.5.3 大棗總黃酮含量測定 取大棗樣品1份，按照3.1項的操作制備大棗樣品溶液，精密量取樣品溶液1 mL，共5份，按照3.4.3項下測定吸光度，計算RSD值為0.26%（n=5），通過計算大棗樣品中總黃酮含量為0.41%，測定結(jié)果見表5。

3.5.4 回收率實驗 稱取已知總黃酮含量（0.41%）的大棗樣品5份，在每份大棗樣品中準確加入0.21 mg/mL蘆丁對照品溶液10 mL，按照3.1項的操作制備大棗樣品溶液。精密吸取上述測定溶液各1.5 mL，于25 mL容量瓶中，按照標準曲線項下方法操作，測定吸光度，由回歸方程求出稀釋液中總黃酮濃度，計算加樣回收率，測定結(jié)果見表6。可知，平均回收率為92.86%，RSD為3.06%（n=5）。

4 結(jié)論

本實驗采用紫外分光光度法測定了大棗中總黃酮的含量，方法學考察實驗證明該法符合微量成分分析的要求，有一定實用價值。操作具有方便快捷、操作簡便、成本低的優(yōu)點，值得推廣使用。

參考文獻：

[1]劉世軍等.大棗化學成分的研究進展[J].云南中醫(yī)學院學報.2015.38（3）：96-99.

[2]沈廣志等.分光光度法測定大棗中總黃酮含量[J].微量元素與健康研究.2011.28（4）：26-27.

[3]林維宣等.紫外分光光度法測定山楂中總黃酮的研究[J].大連輕工業(yè)學院學報.1993.12（2）：42-50.

（收稿日期：2019-04-29）