羅 章 辜雪冬 馬美湖 孫術(shù)國,3* 耿 放
(1西藏農(nóng)牧學院食品科學學院 西藏林芝 860000
2華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 武漢 430070
3中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院 長沙 410004)
牦牛是生活于青藏高原地區(qū)的一種原始種牛,主要分布在西藏、青海、甘肅、新疆、云南和四川等地,全球92%的牦牛生活于此地區(qū)[1-2],由于海拔高、氣候寒冷的氣候特點,所以形成了獨特的遺傳性能[3]。牦牛肉因具有天然無污染、肉質(zhì)鮮美、風味獨特的特點,故近些年來愈來愈受到消費者的青睞[4-5]。在牦牛肉的貯運和消費過程中,新鮮度作為一個綜合反映牦牛肉品質(zhì)及安全性的指標,具有重要的意義[6]。評價牦牛肉新鮮度的檢測方法與一般牛肉相似,主要包括感官評價、微生物和理化檢測[7]。感官評價易受個體主觀因素的影響,而微生物和理化指標的檢測存在耗時、費力等缺點[8]。需要尋求一種客觀、準確和快速的牦牛肉新鮮度檢測方法。
電子鼻(Electronic nose,EN)作為一種集檢測、分析和識別復雜揮發(fā)性成分等功能于一體的新型儀器,其樣品處理簡單、檢測和分析快捷、試驗結(jié)果重復性好和自動化程度高等特點,越來越受到食品科研工作者的重視[9-11]。近年來,針對一些富含揮發(fā)性成分的樣品,出現(xiàn)了基于氣味指紋技術(shù)的新鮮度檢測方法,且已在各種動物制品中進行了應用[12-15]。隨貯藏時間的延長,肉類制品新鮮度下降,在此過程總產(chǎn)生較多的揮發(fā)性物質(zhì),肉的總體氣味發(fā)生劇烈變化[16],因而可使用電子鼻對肉類的新鮮度進行辨別和檢測。
本試驗采用電子鼻分析技術(shù),考察4,25,37℃溫度、不同貯藏時間條件下鮮牦牛肉揮發(fā)性成分的變化規(guī)律;通過對檢測數(shù)據(jù)與感官評定和揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)之間相關(guān)性的研究,建立預測牦牛肉新鮮度的數(shù)學模型,為利用電子鼻技術(shù)快速檢測牦牛肉的新鮮度提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。
1.1.1 原料 牦牛來自西藏區(qū)貢布江達縣種薩鄉(xiāng)天然牧場,選取發(fā)育正常、健康無病、年齡在5歲左右的成年公牦牛,宰殺后取大腿肌,冷凍貯運,4℃解凍后用于試驗。
1.1.2 主要試劑 氧化鎂、硼酸、鹽酸、乙醇、甲基紅、碳酸鈉都為分析純,次甲基藍為化學純,均購買于國藥集團化學試劑有限公司。
1.1.3 主要儀器 Fox 4000氣味指紋分析儀,法國Alpha MOS公司;Yc-950L冷藏箱,中科美菱低溫科技有限公司;GDS-100恒溫恒濕試驗箱,蘇州鑫達試驗設備有限公司;HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱,寧波海曙賽福實驗儀器廠;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;半定量定氮器,銘泰科教儀器設備有限公司;微量滴定管,武漢玻璃儀器廠;SZ-93自動雙重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠;DW-FL90/135超低溫冰箱,中科美菱低溫科技有限公司;SX24-10馬弗爐,上海索譜儀器有限公司。
1.2.1 牦牛肉的貯藏與取樣 取解凍后的牦牛肉,在凈化工作臺內(nèi)分割成約15 g的方形小塊。將肉塊隨機分成3組,均勻擺放在托盤中,用保鮮膜覆蓋后分別貯藏于4℃冷藏箱、25℃和37℃恒溫恒濕箱內(nèi)。4℃樣品每24 h取樣一次,共測定7次;25℃和37℃樣品每12 h取樣一次,共測定5次。取樣時,每樣品取肉塊3塊,分別對肉塊進行電子鼻檢測、感官評定和揮發(fā)性鹽基氮測定。所有樣品均按照“溫度-時間”的格式進行編號,如4℃下貯藏12 h的樣品編號為“4-12”。
1.2.2 氣味指紋分析 取樣后將肉塊用干凈刀具切成肉糜狀,準確稱取2.00 g樣品,裝入自動進樣瓶中(5 mL),立即壓蓋封口,使用電子鼻對其進行揮發(fā)性成分分析。電子鼻檢測參數(shù)如下:樣品平衡溫度45℃,平衡時間為10 min;進樣體積2 500 μL,進樣時間3 s,進樣針溫度45℃;載氣為潔凈干燥空氣,流速200 mL/min;數(shù)據(jù)采集延遲時間180 s,清洗時間90 s。每樣品6個平行,每批次樣品在取樣后1.5 h內(nèi)完成所有檢測[17-20]。
1.2.3 感官評價 該試驗選取感官評定成員20人,其中10位是感官經(jīng)驗豐富的專家,其余10人為本課題組經(jīng)過嚴格篩選的社會人員。感官評價時樣品隨機編號,隨機評定,每次評定由每個評定成員單獨進行,相互不接觸交流。在每次取樣時對牦牛肉的外觀和氣味進行描述,具體指標包括色澤、黏度、彈性和氣味[21]。在良好的自然光線下,首先對表面色澤、外部狀態(tài)進行觀察,并檢查表面氣味;然后將肉塊切開,嗅其內(nèi)部氣味,用手指按壓肉塊,感觸硬度和黏度,并觀察按壓后回復的速度和程度。感官評價完成后按照表1的標準[4,22],對肉塊新鮮程度進行判定,若同一樣品出現(xiàn)不同判定結(jié)果時,以多數(shù)人的判定結(jié)果為準。
表1 鮮牦牛肉感官評定標準Table 1 The sensory evaluation standards of fresh yak meat
1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮測定 揮發(fā)性鹽基氮按照GB/T5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中半微量凱氏定氮法進行測定。具體方法如下:剔除樣品肉塊中的脂肪、筋膜和腱,切成小塊后用剪刀剪碎,攪勻后稱取約10 g,置于錐形瓶中,加100 mL水,常溫下振搖浸漬30 min后過濾;取10 mL硼酸吸收液置于錐形瓶中,加入5~6滴混合指示液,將錐形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入溶液液面以下,準確吸取5.0 mL上述濾液于蒸餾器反應室內(nèi),加5.0 mL氧化鎂混懸液(10 g/L),迅速蓋塞密閉后進行蒸餾,蒸餾5 min即完成;將吸收液用鹽酸標準溶液進行滴定,終點至藍紫色。同時進行空白試驗。滴定重復3次,按下列公式計算結(jié)果,保留3位有效數(shù)字。
式中,X——樣品中揮發(fā)性鹽基氮的值;V1和V2分別為空白和樣品消耗鹽酸標準溶液的體積(mL);c——鹽酸標準溶液的濃度(mol/L);m——試樣質(zhì)量(g)。
1.2.5 數(shù)據(jù)分析和模型建立 采用Office Excel軟件對電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行均值、方差和計算;使用電子鼻自帶的Multivariate Statistics軟件(AlphaSoft software)對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA),檢測分析同一檢測任務條件下各傳感器真利潤的信號“表征特征”。數(shù)據(jù)經(jīng)過篩選后,采用SAS V8.1 軟件(SAS Institute,Cary,NC,USA)進行多元回歸分析,并建立數(shù)學模型。
對4,25和37℃條件下牦牛肉揮發(fā)性成分隨貯藏時間的變化進行分析。由圖1可見,除LY2/g CT外,其他17種傳感器對牦牛肉揮發(fā)性成分的響應值均較高,說明鮮牦牛肉揮發(fā)性成分較為豐富。隨著貯藏時間的延長,牦牛肉脂肪氧化加重,同時微生物逐漸繁殖,分解、代謝產(chǎn)物增多,因此揮發(fā)性成分亦增多[23]。檢測數(shù)據(jù)與之符合,隨著貯藏時間的延長,3種溫度下電子鼻各傳感器的響應值均有增加的趨勢。但4℃下120,144 h和37℃下48 h時的揮發(fā)性成分卻稍有下降,這可能是由于,隨著貯藏進入后期,脂肪氧化和微生物的繁殖都進入一個“平臺期”,揮發(fā)性成分增加有限,而隨著持續(xù)揮發(fā)和消耗,總量有所減少。
經(jīng)進一步的分析可知,雖然各傳感器的響應值隨貯藏時間的延長而增加,但不同傳感器對牛肉揮發(fā)性成分的識別度不同,因此其增加幅度也不同。以4℃貯藏溫度下的電子鼻檢測數(shù)據(jù)為例,LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL和LY2/gCT等6種傳感器響應值可增加5~15倍,T30/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2和T40/2 等 7 種傳感器響應值增加約2倍左右,而P10/1、P10/2、P40/1、T40/1、TA/2等 5種傳感器響應值僅增加15%~40%。已知LY2/AA傳感器對乙醇、丙烷等物質(zhì)靈敏,PA/2傳感器對氨水和胺類化合物較靈敏[24],由此可見,本試驗將更加關(guān)注LY2/AA和PA/2傳感器識別度,其信號作為判別肉的新鮮度的重要參考。由圖1數(shù)據(jù)可知,隨著貯藏時間的延長,上述2種傳感器在牦牛肉貯藏過程中,變化的確較大,具有較好的識別度,也直接反映了牦牛肉中醇類和胺類化合物增加幅度較大。
肉的腐敗主要是由脂肪等成分氧化和微生物繁殖導致[25]。在這一過程中,蛋白質(zhì)逐漸分解為多肽和氨基酸,氨基酸進一步分解可產(chǎn)生硫化氫、氨、酚類和胺類物質(zhì)[26];脂類可被分解為游離脂肪酸和神經(jīng)堿等,或被氧化為低分子內(nèi)酯類、醇類、醛類、酮類及羧酸類物質(zhì)[27]。這些小分子分解或氧化產(chǎn)物均具有一定的揮發(fā)性。因此,隨著貯藏時間的延長,其揮發(fā)性成分逐漸增多,電子鼻氣味傳感器的響應值也逐漸增大。
為了考察不同貯藏溫度對牦牛肉氣味指紋的影響,選取了3中貯藏溫度下0,24和48 h時牦牛肉的電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行分析。由圖2可知,貯藏開始時,3種溫度下牦牛肉電子鼻檢測數(shù)據(jù)的雷達圖基本重疊,揮發(fā)性成分總體較為一致。貯藏24 h后,揮發(fā)性成分的總體輪廓擴大,特別是37℃下樣品的一些傳感器響應值已達到或接近其上限,與25℃和4℃條件下的樣品產(chǎn)生了較大的差異,由此可見,在較高溫度下牦牛肉產(chǎn)生了更多的揮發(fā)性成分。隨著貯藏時間的繼續(xù)延長,在48 h時,3種溫度下牦牛肉揮發(fā)性成分的總體輪廓進一步擴大,25℃和4℃下的樣品亦產(chǎn)生了較大差異。此結(jié)果亦表明各傳感器對貯藏過程中牦牛肉揮發(fā)性成分識別度差異,對于可以反映牛肉腐敗的LY2/AA和PA/2傳感器來說,由圖2判斷PA/2傳感器對分析牦牛肉新鮮度效果更好。
溫度越高,脂肪氧化等各種化學反應和微生物繁殖速度越快,因此各種氧化產(chǎn)物和微生物分解產(chǎn)物也越多[28]。牦牛肉各種營養(yǎng)成分豐富,水分活度高,在37℃條件下,是微生物的天然培養(yǎng)基,在貯藏24 h后,微生物特別是霉菌大量繁殖,產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性成分,因此電子鼻各傳感器的響應值大大增加。由于不同溫度條件下微生物生長速度存在差異,當貯藏48 h時,不同溫度條件下樣品的總體風味輪廓顯現(xiàn)出顯著的差異。
圖1 牦牛肉揮發(fā)性成分隨貯藏時間的變化Fig.1 Volatile composition of yak meat changes with storage time
由以上分析可知,隨著貯藏時間的延長和貯藏溫度的升高,牦牛肉揮發(fā)性成分均表現(xiàn)出增加的趨勢。為了總體考察不同貯藏時間和不同溫度下所有樣品的揮發(fā)性成分變化規(guī)律,對所有樣品的電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行了主成分分析(PCA)。
圖2 貯藏溫度對牦牛肉揮發(fā)性成分的影響Fig.2 The influence of storage temperature on volatile composition of yak meat
主成分分析是一種分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學方法,其目的是在多維數(shù)據(jù)空間中,尋找到一組合適的特征向量,將原有的高維數(shù)據(jù)投影為較低維的數(shù)據(jù)空間,并在此過程中保留數(shù)據(jù)的主要信息,以便在所有的特征中提取主要特征[29-30]。在本試驗中,通過主成分分析,可以將所有18種傳感器檢測數(shù)據(jù)的主要特征提取出來,在保留數(shù)據(jù)信息的前提下簡化數(shù)據(jù),從而使樣品間的數(shù)據(jù)分析變得簡便和直觀。
使用電子鼻自帶的數(shù)據(jù)處理軟件對17個牦牛肉樣品的監(jiān)測數(shù)據(jù)進行主成分分析,結(jié)果如圖3所示。由圖可見,樣品的數(shù)據(jù)點分布具有一定的規(guī)律,“4-0”、“4-24”、“4-48”、“25-0”、“25-12”、“25-24”、“37-0”和“37-12”等處于貯藏前期的樣品均分布于右側(cè),其他貯藏后期的樣品分布于左側(cè)。牦牛肉樣品電子鼻的檢測數(shù)據(jù)主成分1(PC1)貢獻率為 84.465%,主成分 2(PC2)貢獻率為10.384%,表明主成分可以大致反映樣品信息,樣品之間具有有效的區(qū)分。
隨著貯藏的進行,牦牛肉新鮮度逐漸下降,而從PCA結(jié)果表明,電子鼻檢測數(shù)據(jù)與牦牛肉的新鮮度具有一定的相關(guān)性。為了驗證這一推斷,后面試驗進一步討論、分析牦牛肉氣味指紋特征與其新鮮度之間的關(guān)系,對電子鼻檢測數(shù)據(jù)與牦牛肉感官評價結(jié)果及揮發(fā)性鹽基氮測定值之間的相關(guān)性進行了研究。
圖3 牦牛肉揮發(fā)性物質(zhì)的PCA圖Fig.3 PCA diagram of the volatile substances of yak meat
對不同貯藏條件下的17組牦牛肉樣品進行感官評價,從色澤、黏度、彈性、和氣味4個主要方面進行考察,根據(jù)表1的感官評定標準對所有取樣的牦牛肉進行評判,結(jié)果見表2。隨貯藏時間的延長,牦牛肉樣品的色澤、黏度、彈性和氣味的感官評級均逐漸下降。4℃下樣品的感官指標下降較慢,貯藏96 h時由“新鮮”降為“次鮮”,而25℃和37℃樣品下降較快,分別在36 h和24 h時將為“次鮮”。
根據(jù)感官評價,樣品“4-0”、“4-24”、“4-48”、“4-72”“25-0”、“25-12”、“25-24”、“37-0”和“37-12”為“新鮮”,樣品“4-96”、“4-120”、“25-48”和“37-24”為“次鮮”,樣品“4-144”、“25-48”、“37-36”和“37-48”被判定為“變質(zhì)”。由 2.1 節(jié)中 LY2/AA和PA/2傳感器對牦牛肉貯藏過程中與腐敗直接關(guān)系的醇類和胺類化合物較為敏感,作為牦牛肉新鮮程度的表征特征。結(jié)合線性相關(guān)性分析,結(jié)果表明感官評定結(jié)果與樣品電子鼻檢測數(shù)據(jù)的PCA結(jié)果確實存在一定的相關(guān)性,圖3中PC1大于0的樣品可判定為“新鮮”,而PC1小于0的樣品多被判定為“次鮮”和“變質(zhì)”,表明牦牛肉電子鼻檢測數(shù)據(jù)確可作為其新鮮度的評價依據(jù)。
雖然對牦牛肉新鮮度的感官評價結(jié)果接近一般消費者的判斷標準,但感官評價易受評價者個人主觀性和偏好性的影響,因此,需要進一步以較為客觀的理化指標為標準,對牦牛肉電子鼻檢測數(shù)據(jù)與其新鮮度的相關(guān)性進行研究。
表2 牦牛肉感官評定結(jié)果Table 2 The sensory evaluation results of yak meat
揮發(fā)性鹽基氮是能夠比較準確反映鮮肉制品新鮮程度的指標。不同貯藏溫度下,牦牛肉樣品的TVBN值隨貯藏時間的變化見圖4。隨著貯藏時間的延長,牦牛肉的TVBN值逐漸增加,且增加速度有逐漸加快的趨勢,表明在貯藏后期牦牛肉新鮮度急劇下降。
對比感官評定結(jié)果和TVBN測定結(jié)果,兩者具有較好的一致性:TVBN值小于10 mg/100 g時,感官評定結(jié)果多為 “新鮮”;TVBN值大于10 mg/100 g而小于15 mg/100 g時,感官評定結(jié)果多為“次鮮”;“變質(zhì)”肉的TVBN值則大于18 mg/100 g。
圖4 牦牛肉貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)測定結(jié)果Fig.4 Results of volatile basic nitrogen(TVBN)of yak meat during storage
由上分析可知,TVBN值能夠客觀、準確地反映牦牛肉的新鮮程度。為了探討牦牛肉揮發(fā)行成分與其新鮮度之間的關(guān)系,以TVBN值為依據(jù),對電子鼻檢測數(shù)據(jù)與牦牛肉TVBN值的相關(guān)性分析進行了詳細的分析。
2.6.1 電子鼻檢測數(shù)據(jù)的篩選 由2.1節(jié)分析可知,樣品“4-120”、“4-144”和“37-48”由于貯藏時間過久,揮發(fā)性成分有所下降,而樣品“37-24”和“37-36”部分傳感器的響應值出現(xiàn)過載現(xiàn)象,因此,以上樣品的檢測數(shù)據(jù)予以剔除。
某些揮發(fā)性成分波動大或傳感器對其響應不夠穩(wěn)定,使一些檢測數(shù)據(jù)標準方差較大,其中“LY2/LG”、“LY2/G”、“LY2/AA”、“LY2/GH”、“LY2/gCTL”、“LY2/gCT”、“T70/2”和“P30/2”傳感器的響應值均出現(xiàn)相對標準方差(RSD)大于10%,加之這些傳感器所檢測的信號變化,對牦牛肉貯藏過程中與腐敗相關(guān)的主成分變化匹配度低(結(jié)合感官評定),因此剔除上述傳感器的數(shù)據(jù)。
按照上述條件對電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行篩選,將篩選后的數(shù)據(jù)(表3)用于后續(xù)的相關(guān)性分析。
表3 經(jīng)過篩選后的電子鼻檢測數(shù)據(jù)Table 3 The electronic nose data have been screened
2.6.2 傳感器響應值與TVBN值的相關(guān)性 經(jīng)過篩選后,對10種傳感器的響應值與TVBN值的相關(guān)性進行計算。結(jié)果顯示,10種傳感器與TVBN值均具有較好的相關(guān)性(圖5),相關(guān)系數(shù)均大于0.800(表4),最高可達0.953,這些優(yōu)選的傳感器響應值可以作為牦牛肉新鮮度評價的依據(jù)[31]。
盡管這種相關(guān)性僅能體現(xiàn)單個傳感器與TVBN值之間的關(guān)系,為了整體評價所有10種傳感器響應值與牦牛肉TVBN值的相關(guān)性,仍需對數(shù)據(jù)進行深入分析。
圖5 傳感器響應值與TVBN之間的相關(guān)性Fig.5 Relationship between sensor response value and TVBN
表4 傳感器響應值與TVBN的相關(guān)系數(shù)(R)Table 4 The correlation coefficient(R)of sensor response value and TVBN
2.6.3 多元線性回歸分析建立數(shù)學模型 多元線性回歸廣泛應用于一個隨機變量與多個變量之間相關(guān)關(guān)系的分析。在現(xiàn)實問題研究中,某一問題(因變量)往往受到不止一個因素(自變量)的影響,因此需要使用多個因素作為自變量來解釋因變量的變化[32]。當多個自變量與因變量之間為線性關(guān)系時,所進行的回歸分析即為多元線性回歸。在多元性回歸模型中,參數(shù)估計是在誤差平方和為最小的前提下,采用最小二乘法求得[33]。
在本試驗中,假設TVBN值為因變量(y),10種傳感器的響應值為自變量(x),即可通過多元線性回歸建立傳感器的響應值與TVBN值之間的線性關(guān)系。一階多元線性回歸的數(shù)學模型為:
y=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β4x4+β5x5+β6x6+β7x7+β8x8+β9x9+β10x10+ε
其中,β0為常數(shù)項,其中x1-x10分別為10種傳感器的響應值,y為TVBN值,ε為隨機誤差,表示其他隨機因素引起的y值變化。采用零均值假設,通過SAS軟件計算,得回歸模型的決定系數(shù)(RSquare)為 0.9983,調(diào)整決定系數(shù)(Adj R-Sq)為0.9812,剩余標準差(Root MSE)為 0.18561。各因素回歸系數(shù)計算結(jié)果如見表5。
表5 多元線性回歸系數(shù)與檢驗Table 5 Multiple linear regression coefficients and test
于是方程為:
y=-130.7-16.8 x1-119.6 x2+975.9 x3+15.8 x4-114.0 x5+66.6 x6+3.2 x7+28.2 x8-219.3 x9-333.1 x10
根據(jù)此方程計算TVBN的預測值,與實際檢測值進行比較,結(jié)果見表6,各樣品預測值與檢測值之間的殘差均較小,且在“0”值附近呈隨機分布,表明該模型對TVBN值的預測具有較高的準確性。
表6 回歸模型的檢驗Table 6 The assessment of regression model
貯藏時間和貯藏溫度對牦牛肉揮發(fā)性成分均有較大的影響。隨著貯藏時間的延長,各傳感器的響應值均表現(xiàn)為增加的趨勢。不同傳感器的增加幅度不同,其中LY型傳感器的響應值可增加5~15倍,T30/1等7種傳感器響應值增加約2倍左右,而P10/1等5種傳感器響應值僅增加15%~40%,這表明隨著貯藏時間的延長,牦牛肉中醇類和胺類化合物增加幅度較大。在相同貯藏時間下,溫度越高各傳感器的響應值越大,表明高溫有利于反應和微生物的繁殖,從而產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質(zhì)。
主成分分析結(jié)果表明,處于貯藏前期的樣品與貯藏后期樣品具有不同的分布區(qū)域,各樣品之間能夠有效區(qū)分。牦牛肉樣品感官評價結(jié)果與主成分分析結(jié)果具有較好的一致性,主成分分析分布于右側(cè)的樣品多被判定為“新鮮”,而分布于左側(cè)的樣品多被判定為“次鮮”和“變質(zhì)”。
當TVBN值為10 mg/100 g時,感官評定結(jié)果多為“新鮮”向“次鮮”轉(zhuǎn)變,“變質(zhì)”肉的 TVBN值則大于18 mg/100 g。各傳感器響應值與TVBN之間均具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均大于80.0%,最高可達95.3%。通過多元線性回歸對數(shù)據(jù)進行分析,建立了10種傳感器響應值與TVBN值之間的數(shù)學模型,該模型相關(guān)系數(shù)達到?jīng)Q定系數(shù)可達到0.9983,調(diào)整決定系數(shù)為0.9812,剩余標準差為0.18561,表明該模型具有較高的可靠性,可用于牦牛肉新鮮度的預測。