高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定焙烤食品中10種添加劑

劉益鋒，李蓉，劉恭源，張朋杰，容裕棠，張憲臣，胡儀光

（中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東中山528400）

我國GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]中食品添加劑的定義：為改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)。在焙烤食品中，食品添加劑也都發(fā)揮著各自實際的作用與價值。GB 2760-2014 中明確規(guī)定焙烤食品中允許添加的色素和甜味劑種類和限量。有些食品生產(chǎn)者為節(jié)約成本，超量添加合成色素和甜味劑，給人民健康帶來威脅，因此，有必要建立高靈敏、準(zhǔn)確、快速的篩查檢測方法[2]。

目前，已有檢測合成色素和甜味劑類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)[3-6]，測定方法主要有離子色譜法（ion chromatography，IC）[7-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ，HPLC-MS/MS）[11-17]等，現(xiàn)階段合成色素和甜味劑的檢測大多使用液相色譜法。但這些傳統(tǒng)的方法檢出限較高，并且無法從根本上解決基質(zhì)干擾的問題，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。目前尚未見采用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定焙烤食品中合成色素和甜味劑的報道，四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（high resolution mass spectrometer，HR/MS）具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點，高分辨質(zhì)譜可以利用目標(biāo)物母離子的精確分子量直接定量，無需對目標(biāo)物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù)，對于多個目標(biāo)物分析可以極大地降低檢測的時間，同時又能很好地避免受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象。并且靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜具有基于數(shù)據(jù)庫的多種未知物的篩查功能，適用于對食品中多種有害物進行快速篩查[18-20]。

本研究建立超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時測定焙烤食品中10 種合成色素和甜味劑。通過建立該方法，可以對進出口焙烤食品進行有效把關(guān)，同時對保障國內(nèi)焙烤食品的質(zhì)量安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亮藍（Lot.17001）、酸性橙Ⅱ（Lot.17001）、新紅（Lot.17001）、檸檬黃（Lot.17001）、莧菜紅（Lot.17001）、胭脂紅（Lot.17001）、誘惑紅（Lot.17001）標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 mg/mL）：中國計量科學(xué)研究院；糖精鈉（Lot.G134259）、安賽蜜（Lot.G129941）、甜蜜素（Lot.G1319899）（純度均大于等于 98%）：德國 Dr.Ehrensorfer。

乙腈、正己烷（色譜純）：默克股份兩合公司；乙酸銨（分析純）：上海安譜公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000Q-Exactive 高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid coupled with quadrupole/exactive orbitrap mass spectrometry，UPLC-HQMS），配有 HESI Ⅱ離子源：美國Thermo Fisher 公司；Coulter Avanti J-26XP 超高速冷凍離心機：美國BECHMAN 公司；Syncore 平行定量濃縮儀、B-740 再循環(huán)冷卻系統(tǒng)、V-700/701 真空泵：瑞士BUCHI 公司；VORTEX 3 渦旋震蕩器：德國 IKA 公司；DTY-B1200 電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10.0 mg，于各自的10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取適量上述準(zhǔn)儲備液配成亮藍、日落黃、酸性橙Ⅱ、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和糖精鈉濃度為10 mg/L 及安賽蜜、甜蜜素濃度為1 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3（3 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相：乙腈（A）-20 mmol/L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫條件：0～0.5 min，5%A；0.5 min～3 min，5%～50%A；3 min～5 min，50%A；5 min～7 min，50%～90%A；7 min～7.1 min，90 %～5 % A；7.1 min～10min，5 % A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子（heating electrospray ion source，HEIS）源溫度為350 ℃；離子傳輸溫度為320 ℃；鞘氣為40 unit；輔助氣為40 unit；毛細管電壓為3.2 kV；離子傳輸管溫度為325 ℃。Full scan/ddms2 掃描模式：采集范圍為80 Da～1 000 Da，正負切換采集；一級質(zhì)譜分辨率為70000，二級質(zhì)譜分辨率為17500；碰撞池能量（normalization collision energy，NCE） 為 20、40、60 eV，10 種添加劑的質(zhì)量分析和色譜分析參數(shù)如表1 所示。

1.3.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 20 %乙腈1 %氨水溶液，渦旋混合1 min，于 50 ℃水浴超聲 20 min 提取，加正己烷 10 mL，渦旋混合1 min，然后于4 500 r/min 離心5 min，棄去有機相，取2 mL 水相轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000 r/min 離心5 min，清液過0.22 μm 有機相濾膜，供上機測定。

表1 10 種添加劑的質(zhì)量分析和色譜分析參數(shù)Table 1 Parameters of MS and HPLC for 10 additives

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

本方法對流動相的種類進行了考察。比較了甲醇-甲酸乙酸銨水、乙腈-甲酸乙酸銨水、甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨作為流動相時各化合物的分離情況，10 種添加劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖1。

圖1 10 種添加劑物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.1 Chromatograms of 10 additives

甲醇體系和乙腈體系相比較，乙腈體系分離效果更好；流動相中加入甲酸后對色素的峰形和保留時間影響較大，有些峰分裂；流動相中加入乙酸銨后色譜峰峰形得到明顯改善；并對乙酸銨的濃度進行了進一步考察，結(jié)果表明流動相中乙酸銨濃度為20 mmol/L時多數(shù)化合物色譜峰響應(yīng)值較高，峰形尖銳，因此選擇乙腈-20 mmol/L 乙酸銨作為流動相進行梯度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法以流動注射方式對10 種目標(biāo)物在負切換離子模式下進行一級全掃描，采用Q Exactive 高分辨質(zhì)譜的一級母離子全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描模式（Full MS/dd-MS2），設(shè)定涵蓋目標(biāo)物的質(zhì)量數(shù)范圍（50 m/z～500 m/z）進行一級全掃描，并以每個化合物的理論質(zhì)量數(shù)建立二級掃描的目標(biāo)列表。在實際掃描過程中，當(dāng)一級全掃描發(fā)現(xiàn)目標(biāo)列表里的母離子時，且信號強度超過預(yù)設(shè)值后，就會觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴子離子掃描模式，進而獲得對應(yīng)母離子精確質(zhì)量數(shù)的二級離子全掃描質(zhì)譜信息。歐盟EC 2002/657 號文件對多級質(zhì)譜確證時的碎片類型和識別點有明確規(guī)定，禁用物質(zhì)確證須有4 個識別點，在高分辨質(zhì)譜中，母離子的識別點為2.0，子離子的識別點為2.5，因此只需一個母離子和一個子離子即可對目標(biāo)物確證。通過10 種甜味劑和合成色素的二級質(zhì)譜全掃描獲得碎片離子信息，以實現(xiàn)定性確證，避免檢出假陽性或假陰性樣品的情況發(fā)生。

2.3 前處理方法優(yōu)化

試驗發(fā)現(xiàn)如果單獨采用純水體系和乙腈-水體系對待測物進行提取，色素類物質(zhì)的回收率均不太理想，波動較大，這可能由于色素類物質(zhì)大多為苯磺酸鈉型，只有促進其電離，才能在極性的乙腈-水體系中得到較好的萃取結(jié)果，故考慮向體系中添加一定的氨水溶液，增加色素類物質(zhì)在萃取溶液中的電離度進行回收試驗。試驗考察了0、0.5%、1%、2%（體積分數(shù)）氨水對萃取效果的影響，結(jié)果表明：隨氨水含量的增加，色素類物質(zhì)的回收率有一定提高，但是超過1%后，由于提取雜質(zhì)的增加，以及樣品中氨影響檢測物質(zhì)電離，色素類物質(zhì)的回收率波動較大，有時回收率超過200%，嚴重影響分析結(jié)果，也影響到部分甜味劑的萃取和出峰效果，綜合考慮各待測物的萃取效率，通過試驗比較，選擇含1%氨水的乙腈（氨水∶乙腈=20 ∶80，體積比）溶液作為提取劑。為了減少操作步驟及提高提取效率，采用超聲提取方式對樣品進行提取。同時考察了不同提取時間和和提取次數(shù)的提取效果，確定用20 mL 20%乙腈1%氨水溶液，在50℃水浴超聲提取20 min。

2.4 線性范圍與檢出限

在高分辨質(zhì)譜的分析中，其提取的精確質(zhì)量數(shù)色譜圖無基線噪音，因此采用傳統(tǒng)信噪比方法無法定義方法的檢出限。本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的y 軸截距除以斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.3 倍以上數(shù)據(jù)確定檢出限。準(zhǔn)確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備工作液，用乙腈水溶液（乙腈∶水=10 ∶90，體積比）稀釋成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，在1.3 節(jié)條件下依次測定。結(jié)果顯示各種化合物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于 0.995，檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）見表2。

表2 各化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of each compound

2.5 方法的回收率、精密度

用空白餅干、面包、月餅樣品進行添加回收率和精密度試驗。稱取2 g（精確至0.01 g），選取低、中、高3 個合適濃度分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平平行測定3 次，計算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The recovery rate and RSD of the method

從表3 可以看出，各組分的回收率均在64.5%～119.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.5%～9.8%之間（n=6），可見本試驗方法的準(zhǔn)確度與精密度良好。

2.6 樣品測定

利用本研究建立的分析方法檢測18 批實際樣品（其中包括6 批月餅樣品、4 批餅干樣品、2 批面包和6批糕點），其中在1 批餅干樣品中檢出安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、檸檬黃和亮藍，檢出量分別為0.02、0.02、0.02、0.76 mg/kg 和 1.05 mg/kg。GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了允許焙烤食品使用安賽蜜、甜蜜素的最大使用量（烤食品中安賽蜜最大使用量0.3 g/kg、面包、糕點中甜蜜素的最大使用量1.6 g/kg、餅干中甜蜜素的最大使用量0.65 g/kg），而糖精鈉、檸檬黃、和亮藍屬于在焙烤食品中不得使用的添加劑（人工合成色素除焙烤食品餡料及表面用掛漿和糕點上的彩裝外）。可見市場上確實存在焙烤食品違法使用添加劑的現(xiàn)象，建議有關(guān)部門加強監(jiān)管，以保障人民身體健康。

3 結(jié)論

本文建立了同時測定焙烤食品中10 種合成色素和甜味劑的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的方法。該方法具有簡便快捷、測定速度較快，線性相關(guān)性好，準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點，適用于實際焙烤食品樣品中10 種合成色素和甜味劑的檢測，具有較高的實用價值和應(yīng)用前景。