抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜建立及9 種成分同時測定

陳 婷， 成旭東， 王玳珠， 蔣 斌， 沈夕坤

（南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州215009）

抗病毒顆粒是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療機構制劑，批準文號蘇藥制字Z04001821，來源于江蘇省名中醫(yī)何煥榮主任中醫(yī)師經驗方，由金銀花、連翹、蒲公英、野菊花、板藍根5 味藥材組成，具有清熱解毒的功效，適用于急性上呼吸道感染及病毒感染疾病，療效顯著，但原標準僅有性狀鑒別及檢查項，無法全面評價其質量。中藥復方制劑成分復雜，在質量控制中僅采用單一或某幾種成分難以反映其整體特征［1-2］，故本實驗建立抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜，并同時測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷的含有量，從整體上控制該制劑質量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AG285 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-100VDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KDC-140HR 型超速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Milli-Q Synthesis 108 型超純水儀 （美國密理博公司）。

1.2 試藥 綠原酸（批號110753-201415）、咖啡酸 （批 號 110885-201703）、 木 犀 草 苷 （批 號111720-201609）、蒙花苷（批號111528-201710）、連翹酯苷A（批號111810-201606） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 新綠原酸 （批號4974）、隱綠原酸（批號3208）、異綠原酸B（批號3089）、3，5-二咖啡酰奎寧酸（批號6137）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?001） 對照品均購自上海詩丹德生物技術有限公司?？共《绢w粒（批號150307、 150315、 150602、 150608、 151012、151018、 160120、 160128、 160203、 160901、160909、170105） 由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院提供。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -水（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脫，程序見表1；體積流 量1.0 mL／min； 檢 測 波 長320 nm； 柱 溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 對照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，搖勻，即得，冷藏備用。

2.3 供試品溶液制備 將顆粒（批號170105） 研細，精密稱取0.5 g，置于錐形瓶中，加20 mL 蒸餾水稱定質量，超聲（50 Hz） 提取30 min，放冷，加水補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，記錄色譜圖，導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》 （2012 年版），測得相似度在0.997～1.000 之間，表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復性試驗 取同一批顆粒，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》 （2012 年版），測得相似度在0.998 ～1.000 之間，表明該方法重復性良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜圖， 導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》 （2012 年版），測得相似度均為1.000，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.4.2 共有峰標定及歸屬 將相關數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版）， 建立指紋圖譜 （圖1）， 以樣品（170501） 為參照，經過多點校正和數(shù)據(jù)匹配后，平均值法生成對照指紋圖譜R，發(fā)現(xiàn)各主要色譜峰的出峰時間基本一致。同時，發(fā)現(xiàn)17 個共有峰，通過對照品比對和文獻查閱確定其中10 個，分別為新綠原酸（2 號峰）、綠原酸（4 號峰）、隱綠原酸（5 號峰）、咖啡酸（6 號峰）、連翹酯苷A（9號峰）、木犀草苷（10 號峰）、異綠原酸B（11 號峰）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔?2 號峰）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?3 號峰）、蒙花苷（16 號峰）。

通過與單味藥HPLC 圖譜比較，可確定2、4 ～5、10～13 號峰來源于金銀花，6 ～7、9 號峰來源于連翹，2、4 ～6、10 ～13、15 ～17 號峰來源于野菊花，3、6～7 號峰來源于蒲公英，見圖2。

2.4.3 相似度評價 將12 批樣品色譜圖輸出為*.cdf 格式，導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》 （2012 年版），通過多點校正法對色譜峰進行自動匹配，生成共有模式，并在分析檢驗模式下以樣品（批號20170105） 圖譜為參照，時間窗0.10，平均數(shù)法計算相似度。結果，與生成的對照圖譜比較，12 批樣品相似度分別 為 0.995、 0.995、 0.993、 0.995、 0.992、0.992、 0.994、 0.994、 0.994、 0.980、 0.979、0.995，表明各批次之間存在較高的均一性。

圖1 12 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

圖2 各樣品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of various samples

2.4.4 主成分分析 將共有峰峰面積與藥材取樣量之比，即單位質量藥材峰面積通過SPSS 17.0 軟件進行主成分分析，以特征值大于1 為提取標準，得到4 個主成分，累積貢獻率達到91.131%。其中，第 一 主 成 分 λ ＝6.845， 方 差 貢 獻 率 為40.265%，貢獻率最大，包含信息最多；第二主成分λ ＝5.675，方差貢獻率為33.385%；第三主成分λ ＝1.879，方差貢獻率為11.053%；第四主成分λ＝1.093，方差貢獻率為6.428%，因子載荷矩陣見表2。由表可知，峰4、12、15 在第一主成分中有明顯的正相負荷，表明它們在增加，第一主成分增大；峰2 在第一主成分中有明顯的逆負荷；峰7、9 在第二主成分有明顯的逆負荷，峰11 有正負荷；峰8 在第三主成分對主成分起到負相關的作用；峰1 是第四主成分中主要決定因子。

表2 因子載荷矩陣Tab.2 Loading matrices for factors

將因子復合除以主成分相對應的特征值的平方根，可得到主成分系數(shù)表達式，并計算各樣本主成分值。以主成分1、2 分別作為橫、縱坐標，將12批樣品標入坐標系中，得到空間分布圖，見圖3。由圖可知，各批樣品雖有一定距離，但并不大，未實現(xiàn)“分類”，表明它們之間存在一定差異性，但不明顯。

圖3 主成分得分圖Fig.3 Score plot for principal components

2.5 9 種成分含有量測定

2.5.1 色譜條件 在“2.1” 項色譜條件下進行檢測，以各成分色譜峰計，理論塔板數(shù)大于5 000，分離度大于1.5。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ諏φ掌愤m量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，搖勻，即得（質量濃度分別為333.8、440.8、 265.6、 181.4、 144.4、 222.0、 103.2、160.6、161.6 μg／mL）。

2.5.3 供試品溶液制備 同“2.3” 項。

2.5.4 線性關系考察 取“2.5.2” 項下對照品溶液適量，稀釋呈不同質量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進樣10 μL 測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，可知各成分在范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度試驗 取“2.5.2” 項下同一對照品溶液，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ辗迕娣eRSD 分別為0.58%、0.57%、0.68%、0.79%、1.45%、1.17%、1.21%、0.92%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復性試驗 取同一批（批號170105） 顆粒，按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、 蒙花苷峰面積RSD 分別為0.62%、0.70%、1.66%、1.00%、1.03%、1.18%、1.16%、0.79%及0.81%，表明該方法重復性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批（批號170105） 顆粒，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷峰面積RSD 分別為0.73%%、0.83%、0.94%、0.53%、0.88%、0.69%、 0.39%、 0.23%、 0.45%， 表 明 溶 液 在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批顆粒（批號170105）6 份，每份約0.25 g，精密加入等量對照品，按“2.5.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷平均加樣回收率分別為100.89%、101.34%、97.34%、98.36%、102.69%、100.29%、98.03%、99.64%、100.50%，RSD 分 別 為 1.48%、 1.51%、 2.16%、 1.40%、2.20%、1.86%、1.88%、0.79%、1.22%。

2.5.9 樣品含有量測定 精密稱取12 批顆粒，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

3.1 含有量測定成分篩選 抗病毒顆粒中銀花連翹為君藥，既有辛涼透表、清熱解毒作用，又有芳香辟穢功效，臣以野菊花清熱解毒、抗病毒，佐以蒲公英加強解毒、清熱、清火之功，上述藥材均有抗病毒作用［3-5］。

金銀花中含有多種化學成分，主要是揮發(fā)油、黃酮、有機酸、三萜皂苷、環(huán)烯醚苷等，其中有機酸被認為是清熱解毒物質基礎，常以綠原酸為質控標準；黃酮是抗呼吸道病毒感染有效成分［6-9］；連翹主要含有萜類、苯乙醇及其苷類、木脂素、黃酮、揮發(fā)油等化合物，以連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸、蘆丁、連翹酯苷為主［10-11］；野菊花含有綠原酸、木犀草苷、咖啡酸［12-13］等，蒙花苷為其特征成分之一［14］；蒲公英活性物質包括黃酮、酚酸、三萜等［15］。因此，本實驗同時測定綠原酸及其同分異構體（新綠原酸、隱綠原酸）［16-17］、異綠原酸B 及其同分異構體（3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸）［18］、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷的含有量，但由于連翹酯苷A 與其相鄰色譜峰的分離度小于1.5，故不對其進行測定。

3.2 含有量測定方法篩選 本實驗結合二極管陣列檢測器的全波長掃描結果發(fā)現(xiàn)， 各成分在320 nm波長處均有較高吸收，而且基線平穩(wěn)，分離度高，故選擇其作為檢測波長。然后，考察了甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)后者干擾少，各成分分離度較好，為了改善峰形，在水相中又加入甲酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含0.1%甲酸） 洗脫時出峰快，基線穩(wěn)定，分離度高，峰形對稱理想。

4 結論

本實驗建立抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜，并同時測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷9 種成分含有量，該方法準確、重復性好，可用于該制劑質量控制。同時，還發(fā)現(xiàn)色譜峰中除了所測定的指標成分外，還存在多種分離度較好的未知成分，可通過LC-MS等分析方法作進一步確定。