自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸桿菌的分離與鑒定

孟建宇，徐慧欣

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院應用與環(huán)境微生物實驗室, 呼和浩特 010011)

酸菜是大眾化蔬菜腌漬品，在我國歷史悠久，是東北、內(nèi)蒙古等地區(qū)的主要副食品之一，深受消費者的喜愛。研究酸菜發(fā)酵微生物對于酸菜品質(zhì)的提升具有一定的現(xiàn)實意義[1]。乳酸菌是指一類能將可發(fā)酵性碳水化合物降解，產(chǎn)生大量乳酸的非病原性的革蘭氏陽性球菌或桿菌的總稱,主要有乳酸球菌屬、乳酸鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和芽孢桿菌屬[2,3]。乳酸菌能使發(fā)酵酸菜產(chǎn)酸、產(chǎn)細菌素，提高食品營養(yǎng)價值，改善食品風味，延長保存時間，對人體具有多方面的保健作用[4,5]，如能調(diào)節(jié)腸道菌群，維持體內(nèi)微生態(tài)平衡，消除體內(nèi)有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，降低膽固醇，增強免疫力等[6]。對傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究，對于開發(fā)和利用我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蘊含的微生物資源，闡明發(fā)酵蔬菜品質(zhì)的形成機理，進而改進發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)工藝有著重要的現(xiàn)實意義[7]。乳酸菌對食品工業(yè)有重要的經(jīng)濟價值，并且乳酸菌及其細菌素可作為天然來源的食品添加劑[8，9]，因此，對傳統(tǒng)食品中乳酸菌資源進行開發(fā)，篩選出生長性能好、產(chǎn)酸力強、抗性強的優(yōu)良菌株，才能更好地滿足食品工業(yè)發(fā)酵過程。本試驗利用經(jīng)典分類法和16S rDNA序列分析法，對自然發(fā)酵酸菜汁中的乳酸菌進行分離、鑒定，為其進一步深入研究和開發(fā)利用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

農(nóng)家酸菜汁:采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學家屬院自制酸菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏1%；蛋白胨1%；酵母膏1%；葡萄糖1%；番茄汁10%； 吐溫80 0.05%；CaCO32%；溴甲酚綠0.01%；瓊脂1.5%； 蒸餾水100 mL；胡蘿卜汁10%；pH 6.5。

1.1.3 主要儀器設備

JA2003型電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；SX-500 型全自動高溫高壓滅菌鍋 TDMY KOGYO 公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；移液器 Bay Gene Biotech公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；GSP-9080 MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HR40-ⅡA2型生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；T6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Z-16PK離心機 Sigma公司；2720 PCR儀 美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化

采用10倍稀釋法將樣品懸浮液稀釋至10-7, 取每個濃度的稀釋液100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，每個稀釋度做3個重復。觀察平板中菌落生長情況，挑選特征菌落進行分離純化，并對其進行形態(tài)特征觀察和生理生化實驗[10]。

1.2.2 菌株的16S rDNA序列分析

DNA的提取參考文獻[11]的方法。選用細菌通用引物對27F(5′-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3′)和1492R(5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物采用SYBR Green Ⅰ作為標記，在1%(W/V)瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中進行電泳測定。以Marker DL2000作為對照，在紫外燈下觀察DNA譜帶，照相。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京中科瑞泰有限公司)進行純化。用質(zhì)粒連接試劑盒(pMD19-T vector，大連寶生物工程有限公司)進行目的片段的連接。用M13(M13+5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′、M13-5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)引物進行菌落PCR擴增重組質(zhì)粒檢測，將陽性克隆擴培后由中可瑞泰公司測序。獲得的核酸序列用GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行Blast相似性比較，并下載最相似序列。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的形態(tài)和生理生化試驗

從農(nóng)家自然發(fā)酵的酸菜汁中分離到3株乳酸菌菌株，菌落形態(tài)見表1，部分生理生化試驗見表2。3株乳酸菌均為G+菌，菌落邊緣整齊，表面濕潤，不透明，產(chǎn)色素。生理生化試驗顯示：過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗均為陰性，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長。菌落形態(tài)和生理生化試驗顯示符合乳桿菌屬特征。

表1 乳酸菌菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria

表2 乳酸菌的生理生化試驗Table 2 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

2.2 菌株的16S rDNA鑒定

提取菌株的DNA后用瓊脂糖凝膠進行檢測，DNA電泳結果(見圖1)顯示得到的DNA較完整，可用于后續(xù)的分析。對菌株的DNA進行16S rDNA PCR擴增，產(chǎn)物條帶位于Marker的2000～1000 bp之間，約1400 bp(見圖2)，符合預期長度。產(chǎn)物純化后進行pMD19-T載體連接轉化，挑取陽性克隆子進行菌落PCR檢測后測序。測序得到3株乳酸菌16S rDNA部分片段，長度均約為800 bp，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序進行同源性分析，結果見表3。SC2-1、SC2-3、SC4-1與Lactobacillusplantarum的相似度均為100%。

圖1 純菌DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis for the detection of pure bacteria DNA

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR product electrophoretogram

菌株編號Blast最高同源菌 相似度(%) 最高同源屬名SC2-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC2-3Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC4-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬

3 結論與討論

從自然發(fā)酵酸菜汁中分離到3株乳酸菌SC2-1、SC2-3和SC4-1，菌落為圓形，濕潤，表面光滑或凸起，不透明，深綠色；過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗等均為陰性，G+，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長；對其進行16S rDNA序列測定，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序?qū)y序獲得的序列進行同源性分析， 3株菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的相似度達100%。形態(tài)特征和生理生化試驗及16S rDNA序列分析顯示，該3株乳酸菌均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。

酸菜是經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵形成的。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物中既不具備分解纖維素的酶系統(tǒng)，也不具備水解蛋白質(zhì)的酶系。因此，既不會破壞植物細胞組織，又不會分解蛋白質(zhì)和氨基酸；既能保鮮，又可增強產(chǎn)品風味[12]。酸菜中乳酸菌各項性能的優(yōu)劣直接關系到泡菜的質(zhì)量，所以乳酸菌對于提高酸菜的營養(yǎng)價值極為重要。研究自然發(fā)酵酸菜微生物變化趨勢，分離自然發(fā)酵酸白菜中的優(yōu)良菌株，再利用混合發(fā)酵技術模擬自然條件接種發(fā)酵，可在提高產(chǎn)品風味和品質(zhì)的前提下縮短發(fā)酵周期[13]。

植物乳桿菌常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中，是傳統(tǒng)醬腌菜中的優(yōu)勢菌[14]。植物乳桿菌還是人體腸道常見的乳桿菌之一，對調(diào)節(jié)宿主健康具有重要的作用，是目前研究的熱點[15]。相關報道表明，我國一些少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品如酸馬奶、開菲爾等的乳酸菌資源開發(fā)利用較多。內(nèi)蒙古地區(qū)百姓家有制作醬腌菜的傳統(tǒng)，其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源還未被開發(fā)利用。因此，針對從內(nèi)蒙古地區(qū)百姓家庭自然發(fā)酵的醬腌菜中采集、分離獲取的植物乳桿菌進行深入研究，對篩選性狀優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，以及對植物乳桿菌的進一步開發(fā)利用具有重要的意義。