楊 南，丁 婕，閆原野，魯 理，董 凱

視網膜脫離后光感受器細胞死亡的方式有多種，本課題組在國際上首次發(fā)現光感受器細胞的壞死性凋亡的形態(tài)學改變[1]。同時還發(fā)現，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶抑制劑(carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone， z-VAD-FMK)不僅誘導光感受器細胞的壞死性凋亡，同時還參與了自噬的激活[2]。另外，圓柱瘤基因(cylindromatosis，CYLD)干擾可以抑制視網膜脫離后光感受器細胞中的壞死性凋亡和凋亡[3]，但是對壞死性凋亡中的自噬有無影響尚不清楚。另一方面，活性氧、Beclin1、雷帕霉素靶蛋白、磷酸肌醇三磷酸激酶、LC3-Ⅱ等多種蛋白質和信號通路參與了自噬的發(fā)生[4]。Beclin1是早期自噬體形成的必需組分，與自噬體膜的形成有關，并引導募集其他自噬相關蛋白定位于自噬體膜[5]。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換是自噬體形成的標志[6]。該研究探討CYLD干擾對實驗性視網膜脫離中光感受器細胞壞死性凋亡伴發(fā)自噬有無影響，為視網膜脫離后的視功能恢復提供一定理論基礎和干預思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通級健康雄性SD大鼠48只，體質量260～280 g，由安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院和上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院提供，大鼠在室溫18～25 ℃、濕度<60%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1視網膜脫離動物模型的建立 設計CYLD干擾靶序列為5′-GGTTGTACGGATGGAACTTTC-3′，根據靶序列構建慢病毒載體，轉染大鼠視網膜細胞[3]。慢病毒干擾3周后，大鼠分為正常對照組、未干預組、CYLD干預組、陰性干預組，每組12只大鼠，用于電鏡和Western blot檢測各6只。實驗大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，術前0.5%的托吡卡胺擴瞳；左氧氟沙星滴眼液沖洗結膜囊(蘇州參天制藥有限公司)，右眼注入透明質酸鈉(1% 美國博士倫公司)50 μl于視網膜下建立網脫模型，網膜隆起范圍約1/3～1/2。結膜10-0縫線標記脫離范圍，以便取材時定位[1-3]。在各實驗組建立視網膜脫離模型的同時，視網膜下注入z-VAD-FMK (300 μmol/L，美國Enzo公司)5 μl。實驗組大鼠只在右眼建立模型，左眼不做處理做對照。

1.2.2電鏡檢測 建模第3天后，水合氯醛腹腔麻醉大鼠，摘取眼球，沿角鞏膜緣剪開，清除角膜、晶體及玻璃體，剩下的眼杯使用2.5%戊二醛固定12 h，取出視網膜并制成1 mm×3 mm大小條塊，用無水酒精脫水后用環(huán)氧樹脂對標本包埋。做成超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙染法染色[1]。切片的觀察和攝片是使用JEM-1230EX透射電鏡(日本電子公司)，觀察光感受器細胞層的超微結構改變。

確定光感受器位置，單個切片隨機選取觀察的光感受器細胞為200個，確定光感受器細胞的死亡方式是通過視網膜脫離后第3天觀察其形態(tài)學改變。通常光感受器細胞凋亡形態(tài)學表現為細胞體積縮小和細胞核濃縮，細胞壞死的表現為細胞腫脹、溶解，細胞膜破裂、不完整[2,7]。

1.2.3Western blot 建模第3天取視網膜組織，用RIPA裂解液與1%的蛋白酶抑制劑充分裂解，組織勻漿、超聲、離心BCA行蛋白濃度檢測定量；取等量蛋白上樣后凝膠電泳(SDS-PAGE)，初始65 V，當蛋白位于濃縮膠、分離膠交界處，提升為125 V；冰上轉膜2 h，25 V；5%脫脂牛奶室溫封閉40 min；封閉后，膜與LC-3(1 ∶500)、Beclin-1(1 ∶1 000)、β-肌動蛋白(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。復溫后TBST緩沖液洗膜3次，用HRP標記的二抗(在TBST中1 ∶5 000稀釋，圣克魯斯生物技術)室溫孵育2 h，根據說明，通過化學發(fā)光劑ECL顯現條帶[2-3]。使用Bandscan 4.3軟件(加拿大Glyko公司)檢測電泳條帶的灰度值。LC3蛋白、Beclin-1蛋白與內參照β-actin相比，作為其相對表達水平。

2 結果

2.1 CYLD干擾對視網膜脫離后光感受器細胞的影響建立視網膜脫離模型3 d后，電鏡觀察發(fā)現，視網膜脫離后光感受器細胞不僅出現凋亡和壞死，而且還可以觀察到壞死性凋亡的形態(tài)學改變，其與壞死細胞類似，但染色質固縮邊聚，同時可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡。見圖1。CYLD干預組感光細胞壞死數明顯低于未干預組和陰性干預組，差異有統(tǒng)計學意義(F=19.19，P<0.05)。見圖2。

圖1 電鏡下光感受器細胞形態(tài)學特點 ×4 000A：正常對照組；B： 未干預組；C：CYLD干預組；D：陰性干預組

圖2 電鏡下光感受器細胞壞死數與未干預組比較：*P<0.05；與陰性干預組比較：#P<0.05

2.2 CYLD干擾對LC3蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，CYLD干預組的LC3蛋白相對表達較未干預組和陰性干預組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=1623.81，P<0.01)。見圖3。

圖3 Western blot檢測大鼠視網膜LC3蛋白表達與未干預組比較：**P<0.01；與陰性干預組比較：##P<0.01

2.3 CYLD干擾對Beclin-1蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，CYLD干預組的Beclin-1蛋白相對表達較未干預組和陰性干預組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=121.37，P<0.01)。見圖4。

圖4 Western blot檢測大鼠視網膜Beclin-1蛋白表達與未干預組比較：**P<0.01；與陰性干預組比較：##P<0.01

3 討論

本研究結果顯示，慢病毒載體進行大鼠視網膜下注射3周后，建立視網膜脫離模型，網脫模型建立后3 d，取視網膜組織進行電鏡檢測，光感受器細胞的病理學形態(tài)改變不僅是凋亡和壞死，同時部分細胞也表現為染色質固縮邊聚，同時可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡，符合壞死性凋亡伴自噬的表現[8]。LC3、Beclin-1蛋白參與實驗性視網膜脫離后光感受器細胞的壞死性凋亡伴自噬的發(fā)生，CYLD干擾后，LC3、Beclin-1蛋白表達明顯降低，表明光感受器細胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬受抑制，其機制可能是抑制了LC3和Beclin-1的活化。從而可以得出CYLD干擾后，不僅可以抑制光感受器細胞的壞死和凋亡，同時還可以抑制壞死性凋亡中自噬的發(fā)生。

早期研究[9]表明，使用zVAD(一種具有廣泛特異性的泛半胱天冬酶抑制劑)可以誘導L929細胞的自噬和死亡。這種細胞死亡過程需要絲氨酸蘇氨酸激酶1受體相互作用蛋白，提示自噬參與壞死性凋亡。有研究[10]已經證明自噬和壞死都參與了海馬體的神經損傷，而姜黃素確實通過多方面的機制對神經元細胞死亡有神經保護作用。Degterev et al[11]發(fā)現在壞死性凋亡過程中，自噬也可以被激活，并且與微管相關蛋白LC-3I轉化為LC-3II相關。Rosenbaum et al[12]在視網膜缺血模型中發(fā)現，使用z-VAD-FMK預處理后，壞死抑制素-1不僅能抑制壞死，還能抑制自噬，改善功能結果。這進一步驗證了本實驗結果，證實CYLD干擾后，不僅抑制視網膜脫離后光感受器細胞的壞死和凋亡，同時抑制了光感受器細胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。

目前認為自噬主要作為一種保護機制，可以防止細胞死亡，維持細胞完整性主要通過亞細胞碎片的清除和再生代謝前體[13]。在兒童急性淋巴細胞白血病細胞中，需要誘導自噬依賴性壞死性凋亡，以克服糖皮質激素的耐藥性[14]。Kim et al[15]發(fā)現在肺癌的研究中利用紫草素抑制自噬后發(fā)現壞死性凋亡增加。相反，本課題組前期觀察結果表明，自噬標志物LC-3II的活化受壞死信號的控制，這表明自噬參與壞死也導致細胞損傷[2]。這些都表明自噬和壞死性凋亡有對應關系，但是自噬是一個復雜的過程，在壞死性凋亡的過程中自噬是如何被激活的尚不清楚，因此在未來的研究中，有必要探索自噬和壞死性凋亡的聯(lián)系。

綜上所述，在小分子干擾RNA介導的CYLD干擾的大鼠實驗性視網膜脫離模型中，通過抑制LC3和Beclin-1的活化，抑制光感受器細胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。進一步研究自噬、凋亡和壞死性凋亡之間的調控關系，為最大限度抑制細胞死亡，促進細胞存活，保護視網膜細胞提供新的理論依據和治療思路是本課題后續(xù)研究方向。