紫皮豇豆多酚類(lèi)物質(zhì)的含量及其降糖活性研究

吳瓊，王明月，呂岱竹，林冰，陳健

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海口 571101；2.農(nóng)業(yè)部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(海口)，?？?571101；3.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101)

紫皮豇豆(Vignaunguiculatassp. Cylindrica)，蔓生，豆科一年生草本植物，因莢的顏色為紫紅色而得名，耐熱，適合夏季種植[1，2]。研究顯示：紫皮豇豆內(nèi)富含維生素、脂肪、膳食纖維、微量元素和植物蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所含多酚類(lèi)物質(zhì)具有超強(qiáng)的抗氧化能力[3]，有助于人體抵御癌癥、心血管疾病及與機(jī)體衰老相關(guān)的疾病，是優(yōu)良的保健蔬菜，具有較高的保健價(jià)值[4]。目前，發(fā)達(dá)國(guó)家普遍通過(guò)脫水、冷凍等方式對(duì)其進(jìn)行加工，貯藏量與加工量已經(jīng)占到所產(chǎn)蔬菜總量的80%。另外，因其具有質(zhì)地脆嫩、含水量不高的特征，適宜進(jìn)行腌制加工，腌制生產(chǎn)在我國(guó)比較普遍。紫皮豇豆是現(xiàn)代家庭、餐館、航海和軍隊(duì)等理想的常備美味、健康食品。

測(cè)定植物總多酚的方法有很多，有高錳酸鉀滴定法、色譜法及光譜法等[5-11]。其中，高錳酸鉀滴定法是較為傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，利用高錳酸鉀的強(qiáng)氧化性與被測(cè)物中的還原性物質(zhì)作用，此方法的選擇性低、誤差大。常用的色譜法有高效液相色譜法(UV、DAD)、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法(質(zhì)譜-選擇離子監(jiān)測(cè)法)、液相色譜-質(zhì)譜法等，色譜法所用儀器價(jià)格昂貴，而且需要大量的標(biāo)準(zhǔn)品定性、定量，成本較高，僅適用于單體成分的檢測(cè)。光譜分析測(cè)定法是基于顯色反應(yīng)測(cè)定樣品中的多酚含量，常用的方法有可見(jiàn)光分光光度測(cè)定法、酒石酸亞鐵分光光度法、福林-酚比色法等[12，13]。本試驗(yàn)選用福林-酚比色法測(cè)定紫皮豇豆中的多酚含量，該方法具有成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

目前對(duì)紫皮豇豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的研究主要停留在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)上，如蛋白質(zhì)、淀粉和維生素等[14，15]，而真正具有食療保健作用的功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是具有降糖活性的功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)報(bào)道較少。張紅梅等發(fā)現(xiàn)紫紅豇豆中花青素的總量明顯高于綠豇豆和白豇豆[16]；隋華嵩等研究發(fā)現(xiàn)，紫皮豇豆中的紫紅色素水溶性良好，并測(cè)定了紫皮豇豆豆莢與種子紫紅色素的紫外最大吸收波長(zhǎng)[17]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)紫皮豇豆中具有降糖活性成分的相關(guān)研究。本試驗(yàn)采用溶劑提取法提取紫皮豇豆中的多酚，再利用福林-酚比色法測(cè)定紫皮豇豆中的總多酚含量，最后利用體外降糖試驗(yàn)評(píng)價(jià)紫皮豇豆多酚的抗α-葡萄糖苷酶活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紫皮豇豆中的天然、有效且無(wú)毒副作用的功能性營(yíng)養(yǎng)成分，輔助治療糖尿病提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮豇豆：?？谑?，市售，新鮮。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑、無(wú)水碳酸鈉：均為分析純；丙酮：色譜純；α-葡萄糖苷酶：100 U，上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷：pNPG，上海源葉生物科技有限公司；KH2PO4、K2HPO4：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

Synergy 2多功能微孔板檢測(cè)儀；晶安石英96孔酶標(biāo)板；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；電子天平、移液槍以及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制和樣品的制備

稱(chēng)取0.04 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用高純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為400 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱(chēng)取0.01 g阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品，用高純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為100 μg/mL的阿卡波糖母液，稀釋可得1 μg/mL阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱(chēng)取50 g紫皮豇豆樣品，加入盛有500 mL(固液比1∶10)80%丙酮水溶液的裝有蛇形冷凝管的圓底燒瓶中，置于50 ℃水浴中提取5 h，在此過(guò)程中需震搖2～3 次，待提取液冷卻后過(guò)濾，過(guò)濾物再重復(fù)提取2次。合并濾液，在 45 ℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去丙酮，剩余溶液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到多酚提取物2.32 g，分取0.1 g紫皮豇豆多酚提取物于10 mL容量瓶中加水溶解后定容，制成紫皮豇豆多酚提取液，備用。

1.3.2 樣品中總多酚含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取5支10 mL容量瓶，分別加入0，0.05，0.1，0.25，0.4，0.6 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4 mL蒸餾水，混勻后加入0.5 mL福林酚試劑，大約30 s后再加入4 mL 8%碳酸鈉溶液，再用高純水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)30 min后，在740 nm下掃描，以沒(méi)食子酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 樣品的測(cè)定

吸取0.3 mL紫皮豇豆多酚提取液和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10 mL容量瓶中，按1.3.2.1方法反應(yīng)后上機(jī)，計(jì)算樣品中總多酚的含量。

1.3.3 多酚提取物降糖活性試驗(yàn)

在96孔板中分別加入0.5 mL多酚提取液和阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶及67 mmol/L pH 6.9的磷酸鉀緩沖液各20 μL，37 ℃預(yù)保溫15 min后，加入20 μL 6 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，在37 ℃酶解15 min，加80 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，每個(gè)處理分別做4個(gè)重復(fù)，在415 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3.4 方法評(píng)價(jià)

1.3.4.1 重復(fù)性

取5支容量瓶，分別吸取0.3 mL同一批次提取的紫皮豇豆多酚提取液，按照1.3.2.1條件反應(yīng)后測(cè)其吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.4.2 加標(biāo)回收率

取6支10 mL容量瓶，分別加入0.2 mL多酚提取液，再分別加入0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.25 mL 的400 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2.1條件反應(yīng)后測(cè)其吸光度，測(cè)定沒(méi)食子酸的回收率，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.4.3 抑制率曲線的繪制

將阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和多酚提取液分別稀釋2，10，50，250，1250倍，按1.3.3條件反應(yīng)后測(cè)定吸光度，繪制多酚提取液抑制率曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將紫皮豇豆多酚提取液與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用福林-酚比色法，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)定吸光度，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫皮豇豆多酚和沒(méi)食子酸的光譜吸收譜圖Fig.1 Spectral absorption spectra of polyphenols of Vigna unguiculata and gallic acids

由圖1可知，提取液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜曲線輪廓相同，可以選用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)紫皮豇豆的總多酚進(jìn)行定量，兩者的最大吸收峰都在740 nm處，因此選擇740 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 樣品總多酚含量的測(cè)定

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

以沒(méi)食子酸量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～240 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。線性方程為：Y=0.0027X+0.083 ，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9933，其中Y為吸光度，X為沒(méi)食子酸量。

測(cè)量樣品中的多酚含量，見(jiàn)公式(1)：

(1)

式中：Xi為樣品中總多酚含量(mg/100 g)；Ai為提取液吸光度；m為紫皮豇豆樣品的質(zhì)量(g)；M1為提取物凍干后的質(zhì)量(g)；M2為分取的紫皮豇豆提取物質(zhì)量(g)；V1為提取液上機(jī)液體積(mL)；V2為分取的紫皮豇豆提取物定容體積(mL)。

通過(guò)上述公式計(jì)算可得紫皮豇豆中總多酚的含量是614 mg/100 g。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

測(cè)定5組同一批次的紫皮豇豆多酚含量分別為596，643，589，648，595 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%，說(shuō)明該方法具有較高的精密度。

2.3.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表1 總多酚含量測(cè)定方法的加標(biāo)回收率Table 1 Recovery rates of determination method for total polyphenol content

由表1可知，在0～100 μg添加水平，方法的回收率為92.6%～116.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于紫皮豇豆總多酚的測(cè)定。

2.4 提取液降糖活性的測(cè)定

樣品抑制率按公式(2)計(jì)算：

酶活性抑制率(%)=[1-(Abs1-Abs2)/Abs0]×100。

(2)

式中：Abs1是樣品組的吸光度；Abs2是不加酶組的吸光度；Abs0是不加樣品組的吸光度。

通過(guò)上述公式計(jì)算可得紫皮豇豆多酚提取液的抑制率為100.5%，阿卡波糖為99.2%。

提取液和阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后的抑制率見(jiàn)表2。

表2 稀釋后提取液和阿卡波糖的抑制率Table 2 Inhibitory rates of diluted extract and acarbose

阿卡波糖作為已知的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，其作用原理是競(jìng)爭(zhēng)性地與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，從而使淀粉類(lèi)分解為葡萄糖的速度減慢。按照1.3.4.3的方法，平行測(cè)定阿卡波糖及提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

圖3 酶活性抑制曲線Fig.3 Inhibitory curves of enzyme activity

由圖3可知，提取液與阿卡波糖抑制曲線有相同的變化趨勢(shì)，抑制率與相對(duì)濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系，隨著相對(duì)濃度不斷上升，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷增加，當(dāng)相對(duì)濃度為0.1時(shí)，提取液與阿卡波糖抑制曲線均出現(xiàn)拐點(diǎn)，繼續(xù)減少相對(duì)濃度，抑制率變化趨勢(shì)放緩，進(jìn)入平臺(tái)期。阿卡波糖的抑制曲線方程為y=11.039In(x)+63.65，R2=0.8691；提取液的抑制曲線方程為y=12.762In(x)+113.24，R2=0.8805。經(jīng)計(jì)算阿卡波糖的IC50為0.29 μg/mL，而紫皮豇豆提取液的IC50與阿卡波糖相近，為0.34 μg/mL。由此，可以推論紫皮豇豆多酚降糖原理與阿卡波糖相似，可以與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，達(dá)到抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

3 結(jié)論

以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，建立了福林-酚比色法測(cè)定紫皮豇豆中總多酚的方法。結(jié)果表明，在0～240 μg沒(méi)食子酸量與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測(cè)定值為614 mg/100 g，平均加標(biāo)回收率為103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.6%，該方法具有良好的選擇性和靈敏度，適用于檢測(cè)紫皮豇豆中總多酚的含量，也為不同作物中多酚含量的檢測(cè)提供了依據(jù)和參考。另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫皮豇豆多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用，抑制率接近相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，說(shuō)明紫皮豇豆多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶具有體外降糖活性。紫皮豇豆多酚是一種潛在的具有天然降糖活性的功能性營(yíng)養(yǎng)食品，可用于輔助治療糖尿病，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。