魏江存 謝臻 楊正騰 馬家寶 秦祖杰 王成龍 黃冬美 朱文潤(rùn) 陳圣斌 韓倩

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）22-3053-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.06

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定3種不同大黃炮制品中沒食子酸、桂皮酸、兒茶素含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：沒食子酸、桂皮酸、兒茶素的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.126 2～1.262 0 μg（r=0.999 9）、0.036 2～0.362 0 μg（r=0.999 9）、0.177 9～1.779 4 μg（r=0.999 8）;定量限分別為25.4、28.2、62.5 ng，檢測(cè)限分別為6.2、3.6、11.8 ng;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性試驗(yàn)的RSD均小于3%;加樣回收率分別為94.64%～102.71%（RSD=2.74%，n=9）、95.35%～102.49%（RSD=2.44%，n=9）、93.65%～103.66%（RSD=3.27%，n=9）。含量測(cè)定結(jié)果顯示，熟大黃中沒食子酸、桂皮酸含量較高，兩種成分含量大小順序均依次為熟大黃>水蒸熟大黃>生大黃;生大黃中兒茶素含量較高，該成分含量大小順序依次為生大黃>水蒸熟大黃>熟大黃。結(jié)論：本方法靈敏、可靠、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定3種不同大黃炮制品中沒食子酸、桂皮酸和兒茶素的含量。

關(guān)鍵詞 大黃;炮制品;沒食子酸;桂皮酸;兒茶素;反相高效液相色譜法;含量測(cè)定

Simultaneous Determination of Gallic Acid， Cinnamic Acid and Catechin in 3 Processed Products of Rheum officinale by RP-HPLC

WEI Jiangcun1，2，XIE Zhen2，YANG Zhengteng3，MA Jiabao3，QIN Zujie1，WANG Chenglong1，HUANG Dongmei1，ZHU Wenrun4，CHEN Shengbin3，HAN Qian2（1. Zhuangyao Pharmaceutical Research and Development Center， Guangxi International Zhuang Medical Hospital， Nanning 530201， China; 2. School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China; 3. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM， Nanning 530023， China; 4. School of Pharmacy， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of gallic acid， cinnamic acid and catechin in 3 processed products of Rheum officinale. METHODS： RP-HPLC method was established. The determination was performed on Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 278 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of gallic acid， cinnamic acid and catechin were 0.126 2-1.262 0 μg（r=0.999 9）， 0.036 2-0.362 0 ?μg（r=0.999 9） and 0.177 9-1.779 4 μg（r=0.999 8）， respectively. Quantitative limits were 25.4， 28.2， 62.5 ng， and detection limits were 6.2， 3.6， 11.8 ng， respectively. RSDs of precision， stability， repeatability and durability tests were all less than 3%. The recoveries ranged from 94.64%-102.71%（RSD=2.74%， n=9）， 95.35%-102.49%（RSD=2.44%， n=9）， 93.56%-103.66%（RSD=3.27%， n=9）. The determination results showed that the contents of gallic acid and cinnamic acid in prepared R. officinale were higher， and the order of both were prepared R. officinale>steamed R. officinale>raw R. officinale. The content of catechin in raw R. officinale was higher， and the order of it was raw R. officinale> steamed R. officinale>prepared R. officinale. CONCLUSIONS： The method is sensitive， reliable and reproducible. It can be used to determine the contents of gallic acid， cinnamic acid and catechins in 3 processed products of R. officinale simultaneously.

KEYWORDS ? Rheum officinale; Processed products; Gallic acid; Cinnamic acid; Catechin; RP-HPLC; Content determi- nation

我國(guó)共有大黃45個(gè)品種和2個(gè)亞種，其中只有掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（R. tanguticum Maxim. ex Balf.）或藥用大黃（R. officinale Baill.）的干燥根和根莖作為藥用部位被收錄至2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1-2]。大黃在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為中品，《本草綱目》中也有相關(guān)記載[3-4]，可內(nèi)服外用，具有止血、通阻、解毒之功效[5]。臨床常用飲片為生大黃、熟大黃、醋大黃、酒大黃和大黃炭[6]。不同飲片的化學(xué)成分、藥效性能以及臨床作用可能會(huì)隨炮制條件的不同而有所差異，即中藥炮制前后其化學(xué)成分的含量會(huì)發(fā)生變化[7-8]。如生大黃瀉下作用較強(qiáng)，若煎煮時(shí)間過久，其瀉下成分被破壞，使瀉下作用減弱;熟大黃的主要成分為鞣質(zhì)，具有止瀉作用，因此大黃生用能致瀉，熟用則止瀉止痢[9-11]。

大黃主要含有黃酮類、鞣質(zhì)類、蒽醌類、蒽酮類等成分，以往大多數(shù)研究?jī)H以大黃炮制前后蒽醌類成分為指標(biāo)[12-14]。而鞣質(zhì)類成分作為大黃的有效成分之一，具有降低血清尿素氮水平、抗炎、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[15-16]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，大黃炮制前后其鞣質(zhì)類成分沒食子酸和兒茶素的含量均明顯變化，但該研究的觀察指標(biāo)較少[17]。同時(shí)，目前尚無比較不同炮制方法對(duì)大黃中鞣質(zhì)類成分含量影響的研究，也未見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其含量進(jìn)行規(guī)定。基于此，本研究采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定了3種不同大黃炮制品中沒食子酸、桂皮酸和兒茶素等3種鞣質(zhì)類成分的含量，旨在為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（美國(guó)Waters公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）;YQ-520C型超聲波清洗儀（上海音波聲電科技公司）;Secura225D-1CN型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：160928，純度：>98%）、桂皮酸對(duì)照品（批號(hào)：20161126，純度：>98%）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：20161221，純度：>98%）均由寶雞市晨光生物科技有限公司提供;甲醇為色譜純，乙醇、磷酸等均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

大黃飲片（產(chǎn)地：四川綿省陽(yáng)市平武縣，批號(hào)：170307001）購(gòu)自廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李斌副教授鑒定為蓼科植物藥用大黃（R. offi- cinale Baill.）的干燥根莖，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“0213”炮制通則[18]和《全國(guó)中藥飲片炮制規(guī)范》[19]進(jìn)行炮制，制得生大黃、水蒸熟大黃、熟大黃等3種大黃炮制品飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）;檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸對(duì)照品6.31 mg、桂皮酸對(duì)照品3.62 mg、兒茶素對(duì)照品8.897 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，得各成分單一對(duì)照品貯備液。取上述沒食子酸、兒茶素對(duì)照品貯備液各1 mL，桂皮酸對(duì)照品貯備液0.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得沒食子酸、桂皮酸、兒茶素質(zhì)量濃度分別為63.10、18.10、88.97 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將炮制品飲片粉碎，取粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：30 kHz）處理20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。3種炮制品飲片均同法操作。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 以70%甲醇為空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取 “2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，理論板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)均不低于3 000，所有色譜峰的分離度均大于1.5，空白對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、8、10、12、15、20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，沒食子酸、桂皮酸、兒茶素的定量限分別為25.4、28.2、62.5 ng，檢測(cè)限分別為6.2、3.6、11.8 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、桂皮酸、兒茶素峰面積的RSD分別為0.81%、2.34%、0.71%（n=6），表明儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（生大黃飲片）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、桂皮酸、兒茶素峰面積的RSD分別為2.68%、0.88%、1.59%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

將生大黃飲片粉碎， 精密稱取粉末0.5 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中3種成分的含量。結(jié)果，0.5 g生大黃飲片中平均含沒食子酸、桂皮酸、兒茶素4.281 5、0.711 8、3.201 8 mg，RSD分別為0.92%、2.95%、1.97%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

將生大黃飲片粉碎，精密稱取粉末0.25 g，共9份，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 耐用性試驗(yàn)

將生大黃飲片粉碎，取粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別以不同檢測(cè)波長(zhǎng)（268、273、278 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中3種成分的含量（以0.5 g生大黃飲片所含待測(cè)成分質(zhì)量計(jì)），結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取3種大黃飲片粉末，每份0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量（以0.5 g飲片所含待測(cè)成分質(zhì)量計(jì)），結(jié)果見表5。

3 討論

在前期預(yù)試驗(yàn)中，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4，11]，分別以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和無水甲醇為提取溶劑進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以70%甲醇為提取溶劑時(shí)樣品中沒食子酸、桂皮酸、兒茶素的含量相對(duì)較高，故選擇以70%甲醇為提取溶劑。同時(shí)又參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]，分別對(duì)加熱回流、超聲、冷浸等提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流提取所得樣品雜質(zhì)較多且在色譜中不易分離，樣品中3種成分含量易受加熱溫度等因素影響而出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象;冷浸提取所得樣品中3種成分含量較低;超聲提取所得樣品中3種成分含量較高且雜質(zhì)較少，故選擇超聲提取。此外，筆者還比較了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.2%冰醋酸水溶液、甲醇-0.3%冰醋酸水溶液等不同流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果，以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)樣品中3種成分的分離度均較好，且可與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，故選擇以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

生大黃、水蒸熟大黃、熟大黃均為較常見的大黃炮制品，因此筆者測(cè)定了上述3種不同大黃炮制品中鞣質(zhì)類成分的含量并進(jìn)行了比較。含量測(cè)定結(jié)果顯示，熟大黃中沒食子酸、桂皮酸含量較高，上述兩種成分含量大小順序均依次為熟大黃>水蒸熟大黃>生大黃，其原因可能與大黃中的其他成分在炮制過程中受熱后發(fā)生化學(xué)變化或水解而轉(zhuǎn)化為沒食子酸和桂皮酸有關(guān)[17];生大黃中兒茶素含量較高，該成分含量大小順序依次為生大黃>水蒸熟大黃>熟大黃，其原因可能與兒茶素受熱極不穩(wěn)定或發(fā)生水解反應(yīng)有關(guān)[6，20]。

綜上所述，該方法靈敏、可靠、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定3種不同大黃炮制品中沒食子酸、桂皮酸和兒茶素的含量。

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（收稿日期：2019-04-16 修回日期：2019-09-24）

（編輯：陳 宏）