羅奮棋　林院　徐杰

【摘要】 目的：研究微小RNA-543對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存在的保護作用機制。方法：此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠進行研究，采取隨機數(shù)字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組，每組10只，對照組大鼠不進行特殊處理，研究組大鼠接受關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶切斷術(shù)，構(gòu)建建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎（OA）模型，采用PCR檢測方法分別檢測兩組大鼠軟骨組織的microRNA-543表達水平。對大鼠正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進行體外分離，10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h形成體外OA模擬狀態(tài)，使用miR-543 mimics進行轉(zhuǎn)染，觀察分析miR-543過表達對IL-1β誘導(dǎo)條件下軟骨細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達水平的影響。結(jié)果：研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P<0.05）。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組（P<0.05），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組（P<0.05），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升（P<0.05）。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P<0.05），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P<0.05），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后，IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P<0.05）。結(jié)論：OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降，通過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染促進miR-543表達上調(diào)，能夠使軟骨細(xì)胞的增殖得到提升，加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響，能夠有效對抗IL-1β誘導(dǎo)引發(fā)的軟骨細(xì)胞損傷。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA-543; 骨關(guān)節(jié)炎; 軟骨細(xì)胞; 作用機制; 細(xì)胞凋亡

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.24.001 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）24-000-03

【Abstract】 Objective：To study the protective mechanism of microRNA-543 on the presence of chondrocytes in rat osteoarthritis.Method：In this study，20 healthy SD（Sprague-Dawley） rats were randomly divided into study group（n=10） and control group（n=10）.The rats in the study group were treated without special treatment.The rats in the study group underwent medial collateral ligament cutting，and the model of osteoarthritis（OA） was established.The expression of microRNA-543 in cartilage tissue of the two groups was detected by PCR.Rat normal knee cartilage cells were isolated in vitro and cultured with 10 ng/L IL-1β for 24 h to form OA simulation in vitro.The effect of miR-543 overexpression on the proliferation of chondrocytes and the expression level of apoptosis-related genes under the induction of IL-1 under the induction of IL-1 was observed.Result：The expression level of miR-543 in cartilage tissue of the study group was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation rate of cartilage cells induced by miR-543 mimics was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of cartilage cells induced by IL-1β was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of treated cartilage cells induced by IL-1β was significantly increased after miR-543 mimics transfection（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in miR-543 mimics transfected cells was significantly lower than that in the control group（P<0.05）.The expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly higher than that in the control group（P<0.05），and the expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA.The expression of MDM4，Akt1 and Bcl-2 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly relieved after transfection with miR-543 mimics（P<0.05）.Conclusion：The expression of miR-543 in cartilage tissue of OA rats is significantly decreased.The expression of miR-543 is up-regulated by miR-543 mimics transfection，which can enhance the proliferation of chondrocytes and the expression of MDM4，Aktl and Bcl-2.The effect is effective against the chondrocyte damage induced by IL-1β.

【Key words】 MicroRNA-543; Osteoarthritis; Chondrocytes; Mechanism of action; Apoptosis

First-authors address：Fujian Medical University Provincial Clinical College，F(xiàn)uzhou 350001，China

骨關(guān)節(jié)炎屬于關(guān)節(jié)邊緣處的退行性病變，其發(fā)生和發(fā)展與年齡、體重、外部創(chuàng)傷、勞損及先天性異常等因素，具有密切關(guān)系，是多樣因素引發(fā)的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣及軟骨下骨反應(yīng)性增生[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎在老年患者中具有較高的發(fā)病率，屬于常見的慢性疾病，患者會出現(xiàn)緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛及僵硬、腫脹和活動受限等癥狀，對患者的生活質(zhì)量會產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3-4]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制較為復(fù)雜，研究分析認(rèn)為軟骨細(xì)胞的異常遷移和增殖，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)功能異常，可能是導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因，也是臨床治療中最主要的靶標(biāo)[5-6]。微小RNA作為內(nèi)源性非編碼小RNA，能夠翻譯抑制或切割靶基因RNA，進而使蛋白質(zhì)的表達水平下降，對細(xì)胞增殖與凋亡形成調(diào)控作用[7-8]。既往研究中對miR-543在骨肉瘤腫瘤細(xì)胞等方面的作用進行了分析，但對于其在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機制尚未進行研究，相關(guān)作用機制尚不明確[9-11]。此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠進行研究，對比分析正常大鼠和關(guān)節(jié)炎大鼠的microRNA-543表達水平，并通過體外分離和IL-1β誘導(dǎo)，分析miR-543過表達對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因及炎癥因子表達的影響，進一步研究和明確微小RNA-543對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護作用機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠（濟南金豐實驗動物有限公司）進行研究，入組后大鼠均使用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，體重范圍是320～350 g，平均體重（328.46±5.26）g，采取隨機數(shù)字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組，每組10只，對照組大鼠不進行特殊處理，研究組大鼠接受關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶切斷術(shù)，建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎（OA）模型，使用0.5%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，使用劑量為0.35 g/100 g。在完成手術(shù)，兩組大鼠均連續(xù)3 d肌肉注射青霉素，使用劑量是2×104 U/kg。在1周后，驅(qū)趕兩組大鼠進行跑步運動，30 mim/d。入組大鼠的選取和應(yīng)用均符合美國國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南要求。

1.2 實驗方法

軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)和miR-543 mimics轉(zhuǎn)染方法：在無菌環(huán)境下，摘取正常大鼠的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，切下一部分組織進行RNA提取，剩余部分放到含雙抗的磷酸鹽緩沖液中進行清洗，300 g離心處理10 min后，去除上清，使用20%FBS DEME-F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，溫度37 ℃，濕度適度，空氣環(huán)境5%CO2。在實施轉(zhuǎn)染的前1 d，以2×105/cm2的密度，把待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到12孔板上，當(dāng)細(xì)胞融合率達到60%～80%時，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說明要求實施miR-543 mimics轉(zhuǎn)染，并進行相應(yīng)的陰性對照，在驗證轉(zhuǎn)染效率之后實施后續(xù)實驗步驟。

軟骨細(xì)胞增殖能力檢測方法：制取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，于96孔板中進行接種，每孔的接種細(xì)胞數(shù)量是5 000個，每組設(shè)置6個復(fù)孔，并設(shè)立無細(xì)胞空白對照組。在軟骨細(xì)胞miR-543 mimics轉(zhuǎn)染之后，10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h，每孔當(dāng)中加入5 μg/ml的MTT溶液20 μl，在孵育4 h后，去除上清，每孔加200 μl的DMSO，振蕩處理10 min之后，使用酶標(biāo)儀讀取光密度值，重復(fù)三次讀取。

細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和炎癥因子的檢測方法：使用PCR方法檢測，在6孔板中培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞，miR-543 mimics不轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染48 h條件下，10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h，使用TRIzo1試劑盒提取細(xì)胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA之后實施PCR檢測，觀察基因表達水平，按照說明書要求操作。反應(yīng)的條件是90 ℃環(huán)境下3 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別軟骨組織及細(xì)胞中的miR-543表達水平對比

研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠和對照細(xì)胞的miR-543相對表達水平是1.00，研究組的表達水平是（0.62±0.16），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組的水平是（0.74±0.17），研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P=0.012），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞（P=0.024），見圖1。

2.2 miR-543表達水平上調(diào)對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞相對存活情況是（1.00±0.18），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組是（0.51±0.14），miR-543 mimics轉(zhuǎn)染組是（1.29±0.12），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞相對存活情況是（0.89±0.19），miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組（P=0.024），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組（P=0.027），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升（P=0.035），miR-543 mimics轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞增殖作用的抑制效果，見圖2。

2.3 miR-543表達水平上調(diào)對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響分析

研究發(fā)現(xiàn)，對照組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平均是1.00，經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（1.47±0.29）、（0.64±0.18）和（0.49±0.12），miR-543 mimics轉(zhuǎn)染組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（0.46±0.17）、（1.42±0.24）和（1.51±0.18），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（0.97±0.12）、（0.87±0.19）和（0.82±0.11）。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組（P=0.028），Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P=0.024，0.260），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組（P=0.030），Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P=0.028、0.027），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后，IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P=0.022、0.024、0.027），見圖3。

3 討論

此次研究中，通過大鼠OA模型的構(gòu)建進行研究，研究結(jié)果表明，研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P<0.05），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞（P<0.05）;miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組，經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組（P<0.05），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升（P<0.05），miR-543 mimics轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞增殖作用的抑制效果;miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組，Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P<0.05），經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組，Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P<0.05），經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后，IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P<0.05）。研究結(jié)果表明，miR-543表達可能屬于骨關(guān)節(jié)炎分子生物學(xué)的病因，通過miR-543表達水平的監(jiān)測，能夠為骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展情況提供依據(jù)，同時外源性的miR-543補充能夠在骨關(guān)節(jié)炎病情控制中發(fā)揮積極作用。

骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展過程中，軟骨細(xì)胞異常凋亡屬于主要作用機制之一，MDM4能夠定位在凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞器線粒體上，將TP53線粒體的凋亡途徑激活，同時還能夠抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，增加細(xì)胞色素C釋放，進而產(chǎn)生促進細(xì)胞凋亡的效果;至于Akt1能夠?qū)TOR信號通路進行調(diào)控，從而減緩細(xì)胞凋亡。miR-543表達水平上調(diào)后，MDM4表達下降，而Akt1、Bcl-2表達上升，在IL-1β誘導(dǎo)作用后，miR-543表達能夠使MDM4釋放受到抑制，提升Akt1、Bcl-2表達水平[12-13]。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病當(dāng)中，炎癥因子的過表達和病情嚴(yán)重程度具有密切關(guān)系，大量釋放炎癥因子既會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷，還會使軟骨細(xì)胞分化及誘導(dǎo)ECM降解的作用受到影響[14-15]。

綜上所述，OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降，通過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染促進miR-543表達上調(diào)，能夠使軟骨細(xì)胞的增殖得到提升，加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響，能夠有效對抗IL-1β誘導(dǎo)引發(fā)的軟骨細(xì)胞損傷。

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（收稿日期：2019-07-10） （本文編輯：張亮亮）