劉穎, 王鐵山, 劉珍清

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院, 北京 100029)

在藥物臨床前藥理實(shí)驗(yàn)、毒理試驗(yàn)中，血液生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果往往是評(píng)判肝臟功能、腎臟功能、糖代謝和脂代謝等是否正常的客觀而又靈敏的指標(biāo)。大鼠，作為臨床前藥理/毒理試驗(yàn)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，在中長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)需要不同時(shí)間點(diǎn)采血或藥效指標(biāo)多需要血液量大時(shí)，因其血液量有限而難以滿足實(shí)驗(yàn)需求。采血液量越小對(duì)動(dòng)物的損傷越小，符合動(dòng)物福利原則。因此，如何采用最少量的血液來(lái)獲取更多的可靠的檢測(cè)結(jié)果就顯得尤為重要。

在采血容器中預(yù)置抗凝劑等添加劑已成為血液標(biāo)本處理的重要手段, 臨床研究中常有報(bào)道[1-3]采用抗凝血漿進(jìn)行血液生化指標(biāo)的測(cè)定，節(jié)省了分析時(shí)間，改善了臨床治療的及時(shí)性。同樣，抗凝血漿的使用將解決臨床前檢測(cè)指標(biāo)多而血液量少的問(wèn)題[4]。影響大鼠血液生化檢測(cè)結(jié)果的因素有很多[5]，所用抗凝劑的種類將直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)正常SD大鼠的血清、EDTA-K2抗凝血漿、檸檬酸鈉抗凝血漿和肝素鈉抗凝血漿的12種生化指標(biāo)進(jìn)行了比較，為SD大鼠的血液生化指標(biāo)檢測(cè)中抗凝劑的選擇提供了參考。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠21只，體質(zhì)量(200.8±5.2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)-2016-0006]。同一環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，溫度(24.0±1.0)℃，相對(duì)濕度55%～ 65%，動(dòng)物自由進(jìn)食，飲水，12 h/12 h明暗循環(huán)飼養(yǎng)[SYXK(京)2016-0038]。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前動(dòng)物禁食不禁水12 h。

1.2 儀器試劑

AU-480 全自動(dòng)生化分析儀(COULTER)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司; DT5 -2B 低速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。所有生化檢測(cè)試劑均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

生化指標(biāo)共計(jì)12 項(xiàng), 包括: 血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、尿素氮(UREA)、肌酐(Cre)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

21只SD大鼠標(biāo)號(hào)稱體質(zhì)量后, 采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉后, 于腹主動(dòng)脈取血液, 并采用市售的不含抗凝劑的采血管、涂有肝素鈉、檸檬酸鈉和EDTA-K2抗凝劑的2 mL的采血管(江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司)，充分混勻，以3 000 r/min離心15 min，取出上層血清、血漿并利用全自動(dòng)生化分析儀分析每只大鼠四種樣本的12個(gè)生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采取SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)于各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，每項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)值使用表示，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1數(shù)據(jù)顯示，與血清生化檢測(cè)值比較，肝素鈉抗凝血漿的Cre、AST、Alb均明顯降低(P＜0.05)、LDH明顯升高(P＜0.05); EDTA-K2抗凝血漿的AST、LDH、ALP均明顯降低(P＜0.05)、Alb明顯升高(P＜0.05); 檸檬酸鈉抗凝血漿的CHO、UREA、Cre、AST、CK、LDH、ALP、TP、Alb均明顯降低(P＜0.05)。

表 1 血清和抗凝血漿的生化檢測(cè)值比較

與檸檬酸鈉抗凝血漿生化檢測(cè)值比較，肝素鈉抗凝血漿的TG、CHO、UREA、AST、LDH、ALP、TP、Alb均明顯升高(P＜0.05); EDTA-K2抗凝血漿的CHO、UREA、AST、ALT、CK、LDH、ALP、TP、Alb均明顯升高(P＜0.05)。

與EDTA-K2抗凝血漿的生化檢測(cè)值比較, 肝素鈉抗凝血漿的LDH、ALP均明顯升高(P＜0.05),Alb明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查是疾病診治過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其目的是通過(guò)各種離體成分的檢測(cè)提供全面、準(zhǔn)確的機(jī)體狀態(tài)信息。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)血液標(biāo)本的要求也越來(lái)越高。如何準(zhǔn)確規(guī)范地使用抗凝劑是實(shí)驗(yàn)室全面質(zhì)量管理的重要內(nèi)容之一。2002 年WHO 文件[6]《實(shí)驗(yàn)室檢查中抗凝劑的使用》中強(qiáng)調(diào): 使用抗凝血漿可避免血液中待測(cè)成分的改變，與血清比較，其成分能更好反映機(jī)體狀態(tài)，因此部分實(shí)驗(yàn)室檢查推薦首選血漿。該文件中列舉了血液標(biāo)本317 項(xiàng)指標(biāo)，將血液標(biāo)本分為推薦、可用、限制性使用和不宜使用4 類。推薦使用血漿56 項(xiàng)，其中肝素抗凝血漿13 項(xiàng)，EDTA 抗凝血漿17 項(xiàng)，檸檬酸鹽抗凝血漿26 項(xiàng); 推薦使用全血液47 項(xiàng)，其中肝素抗凝全血液7 項(xiàng)，EDTA 抗凝全血液37 項(xiàng)，檸檬酸鹽抗凝全血液3 項(xiàng); 推薦使用血清的項(xiàng)目?jī)H有8 項(xiàng); 尚有204 項(xiàng)血清或血漿均可使用。本研究中涉及到的12項(xiàng)生化指標(biāo)，肝素抗凝血漿中除Glu為限制性使用全血液外，其余指標(biāo)均為推薦或可用；EDTA 抗凝血漿中，除Alb 和ALP為限制性使用或不宜使用，Glu 建議使用全血液外，其余指標(biāo)均為可用。

抗凝劑因成分和抗凝機(jī)制的不同，對(duì)結(jié)果可產(chǎn)生不同的影響。ALP 是一種含鋅的糖蛋白，檸檬酸鹽和EDTA能夠與鋅產(chǎn)生絡(luò)合物，從而抑制ALP 的活性，造成本研究中EDTA 抗凝血漿和檸檬酸鈉抗凝血漿的ALP檢測(cè)值偏低。

目前，臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中仍普遍使用血清進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定[7,8]。針對(duì)中藥的多成分、多活性和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，臨床前實(shí)驗(yàn)中，大鼠的藥效指標(biāo)設(shè)計(jì)較多而大鼠血液量相對(duì)較少，且大多藥

效指標(biāo)的檢測(cè)需要抗凝血漿。因此，生化指標(biāo)的檢測(cè)若能用抗凝血漿代替血清，藥效指標(biāo)和生化檢測(cè)指標(biāo)采用同一份血漿，將解決實(shí)驗(yàn)指標(biāo)多而血液量少的問(wèn)題。當(dāng)出現(xiàn)檢測(cè)指標(biāo)多而血液量不足時(shí)，依據(jù)《實(shí)驗(yàn)室檢查中抗凝劑的使用》[6]和本研究的檢測(cè)結(jié)果，部分檢測(cè)項(xiàng)目可考慮采用肝素鈉抗凝血漿和EDTA 抗凝血漿代替血清進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。