葡萄釀酒皮渣中醋酸菌的分離鑒定及發(fā)酵特征

李 盈 周 瑩 譚玉潔 張坤杰 劉儒圣 姜紅霞

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

果醋是一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品或飲料，它兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能，是集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的新型飲品，被譽為“第四代飲料”[1-2]。葡萄果醋是利用葡萄酒或葡萄酒廠的皮渣等副產(chǎn)物為原料，在優(yōu)良醋酸菌的作用下再次發(fā)酵而成[3]，具有開胃健脾、消除疲勞、促進代謝、增強機體免疫力，祛除皮膚色斑、補血養(yǎng)顏、延緩衰老，解酒醒酒、助眠，降低血液的粘稠度、防治心腦血管疾病等功效，幾乎適合所有人群食用[4-5]。隨著人們保健意識的提高，果醋逐漸進入人們的日常生活。充分利用我國的水果資源，必將帶來良好的經(jīng)濟效益和健康效益[6-7]。

在果醋生產(chǎn)中，發(fā)酵菌種是影響果醋品質(zhì)的關(guān)鍵，是決定其產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素之一[8]。國內(nèi)外對醋酸菌優(yōu)質(zhì)菌株的選育和發(fā)酵機理等方面已有大量研究[9-11]。但目前我國用于果醋生產(chǎn)的主要是食醋用菌種AS1.41醋酸菌和滬釀1.01醋酸菌，用于果醋生產(chǎn)時，其產(chǎn)酸能力、耐酒精能力和產(chǎn)品風(fēng)味都有待提高，因此，選育優(yōu)良的果醋專用菌種是大力發(fā)展果醋產(chǎn)業(yè)的重要問題[12-14]。

本實驗擬從釀酒皮渣中分離鑒定具有優(yōu)良發(fā)酵產(chǎn)酸性狀的醋酸菌，研究其發(fā)酵潛能，為果醋生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

寧夏產(chǎn)赤霞珠釀酒后的葡萄皮渣。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(SW-CJ-2F)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；振蕩培養(yǎng)箱(ZHLY-180S)，上海知楚儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162BS-Ⅲ)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50FBS)，上海申花醫(yī)療器械廠；PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉2%，121℃滅菌20 min，使用前加入無水乙醇至3%。分離培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉1%，碳酸鈣1%，瓊脂2%，121℃滅菌20 min，使用前加入無水乙醇至6%。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉1%，碳酸鈣1%，121℃滅菌20 min，使用前加入無水乙醇至所需濃度。

1.4 菌種的分離

1.4.1樣品的富集培養(yǎng) 分別將3個釀酒皮渣樣品NX1、NX2、NX3接入50 mL富集培養(yǎng)基中，30℃，140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2～3 d。

1.4.2菌種初篩 將富集發(fā)酵液梯度稀釋，取100 μL各稀釋菌液涂布分離培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。挑取透明圈明顯的單菌落進行多次分區(qū)劃線培養(yǎng)，直至顯微鏡檢測為形態(tài)單一的單菌落。

1.4.3菌種復(fù)篩 初篩菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取發(fā)酵液稀釋后涂布平板，挑選透明圈較大的單菌落進行進一步純化，獲得產(chǎn)酸能力優(yōu)良的菌株。所得菌株在含6%乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定酸生成量，對產(chǎn)酸穩(wěn)定的菌株進行菌種保藏，備用。

1.5 菌種鑒定

接種單菌落至發(fā)酵培養(yǎng)基中，140 r/min，30℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h。挑取單菌落加入適量菌體裂解液中，80℃保溫15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液作為PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)引物采用細(xì)菌16S rRNA基因的一對保守引物，引物序列如下[15]：16Sf：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16Sr：5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3'。PCR反應(yīng)系體系(25 μL)：ddH2O, 17.5 μL; 10×PCR Buffer, 2.5 μL; dNTPs, 2.0 μL; 16Sf (10 pmol/μL), 1.0 μL; 16Sr (10 pmol/μL), 1.0 μL; Template, 0.5 μL; Taq DNA polymerase (5 U/μL), 0.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)后再72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序結(jié)果提交(http://www.ezbiocloud.net /eztaxon /identify)網(wǎng)站進行序列分析。采用MEGA 7.0軟件中的Alignment Explorer程序進行多序列同源性分析，并通過該軟件的鄰近歸并法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)[16]。16S rRNA序列在GenBank中注冊。

1.6 產(chǎn)酸量測定

挑取單菌落接種至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h，以空白培養(yǎng)基為對照。取1.2 mL發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL加入9 mL去離子水，2滴0.1%酚酞試劑，堿式滴定管滴定，根據(jù)消耗氫氧化鈉的體積，計算產(chǎn)酸量[17]。每隔24 h取樣1次。

X：樣品醋酸含量(g/100 mL)；C：標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定液濃度(0.05 mol/L)；v0：空白培養(yǎng)基消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)；v1：樣品消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)；v2：樣品體積(mL)；60為醋酸摩爾質(zhì)量(g/mol)。以產(chǎn)酸量(g/100 mL)為縱坐標(biāo)，發(fā)酵天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.7 產(chǎn)酸特性研究

1.7.1乙醇濃度對醋酸發(fā)酵的影響 在50 mL液體培養(yǎng)基中，固定接種量4%，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)，以2%、4%、6%、8%、10%乙醇濃度作為變量，每隔24 h測1次產(chǎn)酸量，直到產(chǎn)酸量趨于平穩(wěn)或下降。每個乙醇濃度做3個平行。

1.7.2接種量對醋酸發(fā)酵的影響 在50 mL液體培養(yǎng)基中，固定乙醇濃度6%，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)，以2%、4%、6%、8%、10%乙醇濃度作為變量，每隔24 h測一次產(chǎn)酸量，直到產(chǎn)酸量的數(shù)值趨于平穩(wěn)或下降。每個接種量做3個平行。

1.7.3溫度對醋酸發(fā)酵的影響 在50 mL液體培養(yǎng)基中，固定乙醇濃度6%，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)，以27℃、30℃、33℃、36℃、39℃的溫度作為變量，每隔24 h測1次產(chǎn)酸量，直到產(chǎn)酸量的數(shù)值趨于平穩(wěn)或下降。每個溫度做3個平行。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理與曲線繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的篩選結(jié)果

醋酸菌在含有碳酸鈣的固體培養(yǎng)基上會產(chǎn)酸，溶解碳酸鈣而產(chǎn)生透明圈，透明圈的大小和強弱與醋酸菌的產(chǎn)酸能力成正比。經(jīng)過菌種初篩和復(fù)篩，獲得31株能產(chǎn)生透明圈的菌株，其中4株菌產(chǎn)生透明圈所需時間較短，直徑較大，編號分別為1,5,10,11。將這4株菌保存，進行菌種鑒定和發(fā)酵性能測定。

2.2 菌株鑒定

4株產(chǎn)酸菌菌落呈乳白色，圓形，中間隆起，邊緣整齊或鋸齒狀，表面光滑，革蘭氏染色陰性。以菌落裂解液作為PCR模板，擴增菌株16S rRNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜如圖1。

圖1 菌種1,5,10,11的16S rRNA基因片段1%瓊脂糖凝膠電泳

上海生工測序結(jié)果表明，4株菌的16S rRNA基因序列全長分別為1 398、1 393、1 395、1 393 bp。經(jīng)序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株菌均屬于蘋果醋酸菌(A.malorum)，其序列與模式菌株LMG1746(T)的16S rRNA基因序列同源性均大于99%。結(jié)合菌株的菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特征，將其鑒定為蘋果醋酸菌[18]。根據(jù)后續(xù)發(fā)酵實驗得知，菌株11的產(chǎn)酸效能最高，因此將菌株11的16S rRNA基因在Genbank注冊，登錄號為MK583489，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

2.3 菌株發(fā)酵性能研究

2.3.1乙醇濃度對醋酸發(fā)酵的影響 乙醇是醋酸菌發(fā)酵的基礎(chǔ)物質(zhì)，為醋酸菌生長代謝提供能量，在醋酸菌生長過程中乙醇被氧化成乙酸。由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵時間為8天時，乙醇濃度為6%的樣品產(chǎn)酸量達(dá)到最大值，乙醇濃度為4%的產(chǎn)酸量僅次于最大值；乙醇濃度為8%的樣品產(chǎn)酸量介于中間；而乙醇濃度為2%和10%的樣品，產(chǎn)酸量最低。這表明菌株11的最適合的乙醇濃度介于4%～6%之間，濃度太低(2%)，可能因為乙醇含量不足，醋酸菌生長過慢，但是較高的初始乙醇(10%)對醋酸菌的生長和代謝會產(chǎn)生一定的底物抑制作用，二者都不利于產(chǎn)酸量的增長[19]。

圖3 乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響

2.3.2接種量對醋酸發(fā)酵的影響 由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，產(chǎn)酸量整體都處于上升的狀態(tài)，第7天后趨于平穩(wěn)，當(dāng)接種量為6%時，產(chǎn)酸量最高。接種量過低，菌體整體生長勢弱，產(chǎn)酸量低；但是接種量過高，發(fā)酵液中所含的醋酸菌量也較大，造成培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)消耗較多，生成醋酸的底物較少，產(chǎn)酸量會下降。

圖4 接種量對產(chǎn)酸量的影響

2.3.3溫度對醋酸發(fā)酵的影響 溫度是影響醋酸菌生長代謝的重要因素，是醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的必要條件。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長速度和代謝速率變快，產(chǎn)酸時間縮短，提高經(jīng)濟效率。隨著溫度的升高，醋酸菌的生長及產(chǎn)酸呈現(xiàn)先增長后降低最后衰亡的趨勢；在耐受溫度前的一段溫度梯度內(nèi)，菌種的生長及產(chǎn)酸波動幅度較小，當(dāng)溫度達(dá)到菌種的耐受點時，菌種生長會急劇惡化，產(chǎn)酸幾乎停止，最后衰亡[19]。由圖5可知，當(dāng)溫度為33℃時，產(chǎn)酸量隨著發(fā)酵時間的增加一直處于上升的趨勢，在第5天達(dá)到最高值，而當(dāng)溫度為36℃、39℃時，產(chǎn)酸量幾乎趨近于零，證明溫度太高會抑制醋酸菌的生長，進而使產(chǎn)酸量很低。當(dāng)溫度為27℃和30℃時，醋酸菌的產(chǎn)酸量曲線數(shù)值相差不大，在第3天達(dá)到最大值而后趨于平穩(wěn)。

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計發(fā)酵條件為乙醇濃度5%，接種量5%，溫度31℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵7天測得菌株11的產(chǎn)酸量為4.2 g/100 mL。

圖5 溫度對產(chǎn)酸量的影響

3 結(jié) 論

本實驗通過富集培養(yǎng)法從寧夏產(chǎn)赤霞珠葡萄釀酒后的皮渣中篩選出了31株產(chǎn)酸菌，其中4株菌在篩選培養(yǎng)基上透明圈較大，產(chǎn)酸能力較強。經(jīng)形態(tài)特征和16S rRNA分子鑒定，確定4株菌均屬于蘋果醋酸菌(A.malorum)。研究了乙醇濃度、接種量、溫度等因素對菌株11在發(fā)酵產(chǎn)酸過程中的影響，并優(yōu)化發(fā)酵條件，菌株11在實驗條件下產(chǎn)酸量可達(dá)到4.2 g/100 mL。

圖2 臨近歸并法構(gòu)建菌株11的系統(tǒng)發(fā)育樹

醋酸菌種是決定果醋產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一。目前，果醋釀造的優(yōu)良菌株分為醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡糖桿菌屬(Gluconobacter)2個屬[20]。許氏醋酸桿菌(A.schutzenbachii)是國外有名的速釀醋酸菌種,也是目前制醋工業(yè)較重要的菌種之一。奧爾蘭醋桿菌(A.acetisubsp.orleanensis)是法國奧爾蘭地區(qū)用葡萄酒生產(chǎn)醋的主要菌株[12]。迄今為止，國內(nèi)科研人員已經(jīng)分離了多株可用于果醋生產(chǎn)的醋酸菌菌種[12-14, 17]，但是大多數(shù)仍處于實驗室研究階段，在生產(chǎn)中應(yīng)用最多的果醋菌種仍然是用于食醋釀造的惡臭醋酸桿菌(A.rancens)、滬釀醋酸桿菌(A.pasteurianusHN1.01)、巴氏醋酸桿菌羅旺亞種(A.pasteurianussubsp.lovaniensis)。分離優(yōu)質(zhì)高效的菌株，并將所得菌種資源用于生產(chǎn)果醋的實際應(yīng)用中，才能將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，因此，本研究的下一步工作是將所分離篩選的菌株進行發(fā)酵果醋的應(yīng)用研究。