胡楚霄， 唐恬恬， 師 展， 羅霆宇， 向泉桔

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院微生物系，四川 成都 611130)

我國是世界食用菌生產(chǎn)第一大國，食用菌產(chǎn)量達到世界工廠化總產(chǎn)量的43%[1]。隨著工業(yè)的快速發(fā)展、“三廢”的大量排放以及不合理的施肥和農(nóng)藥的使用，土壤和栽培基質(zhì)(木屑、秸稈等)的重金屬污染對食藥用菌人工栽培的影響越來越大[2-3]。目前在食用菌中常見被檢出的超標重金屬有銅、鋅、鎳、鎘等[4]。因此，開展相關(guān)研究對于評價其環(huán)境污染風(fēng)險、保護人體健康、保障食品安全具有重要意義。 食用菌富集與轉(zhuǎn)運重金屬的機制主要包括產(chǎn)生抗氧化酶、離子交換、與大分子結(jié)合形成沉淀、肽轉(zhuǎn)運等[5]。肽轉(zhuǎn)運是生物中普遍存在的一種現(xiàn)象，其中寡肽轉(zhuǎn)運蛋白(Oligopeptide transporter，OPT)是肽轉(zhuǎn)運的通道之一，能轉(zhuǎn)運4～8個氨基酸的短肽。寡肽轉(zhuǎn)運蛋白的功能多樣，可以協(xié)助胞外物質(zhì)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，參與營養(yǎng)的分配及金屬耐受性和解毒等，其轉(zhuǎn)錄表達受培養(yǎng)條件、生長階段等外界因素的影響[6]。寡肽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量的大小與菌絲體富集的重金屬量密切相關(guān)。OPT蛋白最先在致病白色念球菌中發(fā)現(xiàn)[7]，隨后相繼在擬南芥、水稻、黃孢原毛平革菌等物種中發(fā)現(xiàn)[8]，目前研究最多的是擬南芥OPT基因家族。Pu等[9]研究表明，在長期的進化過程中，金屬離子對于OPT基因家族的多樣性起到了很重要的作用，例如BrrOPT8.1和BrrYSL7分別對鐵和鈣離子有特化響應(yīng)，表明不同的OPT基因?qū)τ诮饘匐x子的響應(yīng)存在差異。 靈芝是一種名貴的藥食兩用真菌，富含豐富的甾醇、萜類等生物活性物質(zhì)，現(xiàn)已實現(xiàn)大規(guī)模人工栽培[10]。栽培基質(zhì)和土壤中的金屬可能會影響靈芝的生長發(fā)育。本課題組前期研究結(jié)果顯示[11-12]，靈芝的生長發(fā)育、多糖含量及OPT基因的轉(zhuǎn)錄表達水平受到多種金屬離子的影響，其中Cu2+和Fe2+的脅迫下，OPTs基因在不同發(fā)育階段 (15 d和30 d)的轉(zhuǎn)錄表達水平發(fā)生較大的變化，顯示出這兩種金屬離子對于OPTs基因具有較大的影響。為進一步分析Cu2+和Fe2+處理對OPTs基因的影響，本研究設(shè)置了不同濃度梯度的Cu2+和Fe2+，分析其對靈芝生物量、多糖含量以及OPT基因轉(zhuǎn)錄表達水平的變化，為進一步闡明這兩種金屬離子對于靈芝生長發(fā)育的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 靈芝菌種榮保1號，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基；PDB液體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，pH自然，定容至1 000 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器 CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、瓊脂粉、無水葡萄糖、98%硫酸(分析純，四川西隴科學(xué)化工有限公司)；無水乙醇(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；Trizol Reagent(上海生工生物試劑有限公司)；FastQuant cDNA合成試劑盒(天根生化科技有限公司)；SYBR Green Master Mix(唯諾贊生物科技有限公司)。熒光定量PCR儀(iQ5型，美國Bio-rad公司)；分光光度計(V-1100D型，美譜達)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 將CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O配置成50 mg/L的母液，其中CuSO4·5H2O 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，F(xiàn)eSO4·7H2O使用0.22 μm濾膜過濾除菌。菌種保藏與活化使用PDA固體培養(yǎng)基，菌種的培養(yǎng)使用PDB液體培養(yǎng)基。每個250 mL錐形瓶中加入50 mL PDB培養(yǎng)基，115 ℃滅菌 20 min。滅菌后添加一定量的金屬離子母液，至預(yù)設(shè)濃度(0、50、100、200、400 mg/L)。每個三角瓶接種3塊活化的菌絲體(直徑1 cm)，30 ℃避光恒溫靜置培養(yǎng)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 生物量測定 取完整的菌絲體，60 ℃烘至恒重，于分析天平上稱取重量，數(shù)值記為生物量測定值。

1.2.3 多糖含量測定 利用苯酚-硫酸比色法測定靈芝粗多糖含量[13]，具體步驟如下：準確稱取烘干后的菌絲體0.5 g，加入50 mL超純水與1 mL 1%的纖維素酶，靜置30 min，然后沸水回流提取2 h。將液體轉(zhuǎn)入離心管中，低速(6 000 r/min)離心5 min，取500 μL上清，加入3倍體積無水乙醇至終濃度75%，4 ℃醇沉過夜。室溫高速(12 000 r/min)離心5 min，去上清，烘干沉淀。加入1 mL超純水溶解沉淀，再加入1 mL sevage(氯仿∶正丁醇=5∶1)試劑反應(yīng)30 min去除蛋白質(zhì)。吸取400 μL上清液加入1 mL 5%苯酚溶液與5 mL 98%濃硫酸，室溫反應(yīng)30 min，490 nm波長處測定吸光度值。

1.2.4 總RNA提取 取少量液氮保存的菌絲體，研磨成粉末狀，利用Trizol法提取總RNA[14]，具體步驟如下：將樣品迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末狀，裝入預(yù)冷的1.5 mL離心管中；向樣品離心管中加入1 mL Trizol試劑，迅速震蕩搖勻，室溫靜置5 min；向勻漿裂解液中按每1 mL裂解液試劑加入200 μL的比例加入氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min；12 000 g、4 ℃離心5 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒至充分混勻，室溫靜置10 min；12 000 g、4 ℃ 離心10 min；棄上清，向離心管中加入l mL 75%乙醇，洗滌離心管管壁，12 000 g、4 ℃離心5 min；棄去乙醇；室溫干燥沉淀至乙醇完全揮發(fā)，加入50 μL RNase-free水溶解沉淀。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.5 cDNA合成 檢測合格的RNA使用FastQuant cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 qRT-PCR分析 以合成的cDNA為模板，對相關(guān)OPT基因進行qRT-PCR分析，以未加金屬離子的CK為對照，計算OPT基因在特定環(huán)境下轉(zhuǎn)錄表達情況。qRT-PCR在iQ5熒光定量PCR儀上進行。熒光定量PCR反應(yīng)體系共計10 μL，具體如下：Green Master Mix 5μL，Rox Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，引物0.4 μL，加入ddH2O補足至10 μL。qRT-PCR分析具體程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)，60 ℃退火。以靈芝RPL4基因為內(nèi)參基因[15]，所用引物序列參照文獻[16]，通過熔解曲線判定引物的特異性，利用雙δ法計算基因的相對表達量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析處理 實驗數(shù)據(jù)利用Excel進行數(shù)據(jù)整理計算制表，利用Spss Statistics17.0進行顯著性分析，利用Origin進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe2+和Cu2+對靈芝生物量的影響

不同濃度Fe2+和Cu2+作用下，靈芝的生物量如表1所示。結(jié)果顯示，培養(yǎng)前期(15 d)，不同濃度Fe2+對靈芝的生長具有一定的促進作用，隨著Fe2+濃度的增加，生物量也有一定程度的增加，不同濃度的Cu2+對靈芝生長則存在一定的抑制作用，隨著濃度的增加，生物量不斷降低。與培養(yǎng)前期變化趨勢一致，培養(yǎng)后期(30 d)不同濃度Fe2+表現(xiàn)出促進作用，但不同濃度Cu2+則表現(xiàn)出抑制作用。在所有的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)后期的生物量均低于培養(yǎng)前期，這可能是由于培養(yǎng)后期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，導(dǎo)致菌絲生長進入了穩(wěn)定期甚至衰亡期。

2.2 Fe2+、Cu2+對靈芝多糖含量的影響

培養(yǎng)前期(15 d)，兩種金屬離子均抑制靈芝多糖的生物合成，不同濃度處理下多糖的含量均低于對照組；培養(yǎng)后期(30 d)，兩種金屬離子對靈芝多糖的生物合成具有一定的促進作用，F(xiàn)e2+和Cu2+分別在200 mg/L和400 mg/L的促進作用最明顯，其多糖含量分別達到1.39%和1.30%(表2)。

表1 不同濃度Fe2+和Cu2+對靈芝生物量影響(g)

注：表中小寫字母表示在α=0.05條件下的顯著性檢驗結(jié)果，下表同

表2 不同F(xiàn)e2+和Cu2+對靈芝胞內(nèi)多糖含量影響(%)

2.3 Cu2+和Fe2+脅迫下靈芝OPTs基因的轉(zhuǎn)錄表達情況

利用qRT-PCR分析不同Cu2+和Fe2+濃度脅迫下靈芝寡肽轉(zhuǎn)運蛋白家族的響應(yīng)特征。與已有研究結(jié)果類似[14]，本研究仍未檢測到OPT7、OPT8和OPT9的轉(zhuǎn)錄本，其余10個基因均出現(xiàn)了差異性和特異性表達。

不同濃度Cu2+脅迫下，在培養(yǎng)15 d的樣品中，OPTs基因表達水平較低，且大多數(shù)基因表達水平差異不大；而在30 d的樣品中，表達水平較15 d的樣品明顯增加，且所有的基因表達水平均存在差異。15 d樣品中，在不同Cu2+濃度下5個基因(OPT1、OPT2、OPT3、OPT4和OPT11)的轉(zhuǎn)錄表達水平較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；OPT5、OPT6和OPT13分別在Cu2+質(zhì)量濃度為200 mg/L、400 mg/L和50 mg/L時轉(zhuǎn)錄表達水平最高，其中OPT6在濃度為400 mg/L時的轉(zhuǎn)錄表達水平是CK的33.59倍；OPT10和OPT12的轉(zhuǎn)錄表達存在一定的波動性，但這兩個基因均在Cu2+濃度為50 mg/L和200 mg/L的樣品中轉(zhuǎn)錄表達水平相對較高。30 d樣品中，Cu2+脅迫下所有基因的轉(zhuǎn)錄表達水平均不同程度提高，其中4個OPT基因(OPT1、OPT2、OPT12和OPT13)均在Cu2+質(zhì)量濃度為100 mg/L時轉(zhuǎn)錄表達水平最高，分別為CK的47.27、118.01、6.10和41.95倍，另外5個OPT基因(OPT3、OPT5、OPT6、OPT10和OPT11)在Cu2+質(zhì)量濃度為400 mg/L時的轉(zhuǎn)錄水平最高，分別為CK的5.37、4.84、36.73、17.87和6.04倍(圖1)。

不同濃度Fe2+脅迫下，各基因表達差異水平均較大。在培養(yǎng)15 d的樣品中，OPTs基因表達水平較Cu2+高。而30 d培養(yǎng)的樣品中，2個OPTs基因(OPT3和OPT11)表達水平不及15 d，另有2個OPTs基因(OPT1和OPT4)明顯高于15 d。15 d樣品中，除OPT4基因外，各基因在Fe2+質(zhì)量濃度為50 mg/L與400 mg/L時表達量較高。OPT5、OPT6和OPT10為表達量最大的基因：在質(zhì)量濃度為50 mg/L時分別為CK的35.61、207.48和102.39倍；在質(zhì)量濃度為400 mg/L時分別為CK的33.61、164.31和139.27倍。其余濃度條件下，各基因表達量與差異性均較小，大部分較CK下調(diào)。30 d樣品中，6個OPT基因(OPT1、OPT2、OPT3、OPT5、OPT12和OPT13)在Fe2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時表達量最大，分別為CK的32.63、9.67、6.87、14.67、12.69和7.89倍，另外3個OPT基因(OPT6、OPT10和OPT11)在Fe2+質(zhì)量濃度為400 mg/L時表達量最大，分別為CK的132.62、32.06和19.70倍(圖2)。

圖1 OPTs在不同Cu2+濃度脅迫下不同培養(yǎng)階段的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of OPTs under different concentrations of Cu2+ treatments and culture stages

圖2 OPTs在不同F(xiàn)e2+濃度脅迫下不同培養(yǎng)階段的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of OPTs under different concentrations of Fe2+ treatments and culture stages

3 討 論

在食用菌培養(yǎng)過程中，添加適量的金屬離子可以促進其生長發(fā)育[17]，但是關(guān)于誘導(dǎo)機制的研究報道相對較少[18-19]。蔡愛群等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Fe2+質(zhì)量濃度低于800 mg/L、Cu2+質(zhì)量濃度低于100 mg/L，均可以明顯促進靈芝的生長。本研究中，不同濃度Cu2+抑制菌絲的生長，生物量降低，這可能是由于不同靈芝菌株對金屬濃度敏感性存在差異。 王新民等[22-23]的研究結(jié)果顯示當(dāng)Fe2+含量為0.2%時，多糖產(chǎn)量最高。與此結(jié)果相似，本研究中Fe2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時，靈芝胞內(nèi)多糖含量最高。 寡肽轉(zhuǎn)運蛋白的功能多樣，可以協(xié)助胞外物質(zhì)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，參與營養(yǎng)的分配及金屬耐受性和解毒等，其轉(zhuǎn)錄表達受培養(yǎng)條件、生長階段等外界因素的影響[7]。通過酵母異源表達研究證實擬南芥AtOPT3可以轉(zhuǎn)運Cu2+、Mn2+和Fe2+三種金屬離子[24]。Hu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，缺Fe2+環(huán)境下高富集植物天藍遏藍菜OPT3(TcOPT3)在莖和葉中的轉(zhuǎn)錄表達水平比對照顯著增高，且均隨著培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)錄表達水平有下降的趨勢。突變酵母菌驗證實驗證實TcOPT3不僅可以轉(zhuǎn)運Fe2+，還可轉(zhuǎn)運Zn2+、Cd2+和Cu2+，說明TcOPT3是一個新的轉(zhuǎn)運Fe/Zn/Cd/Cu的蛋白。本研究結(jié)果表明不同Cu2+和Fe2+濃度處理下，靈芝OPT基因在不同發(fā)酵階段(15 d和30 d)具有差異性表達特征，這些結(jié)果表明OPT基因在多種生物金屬離子的轉(zhuǎn)運和耐受過程中起著重要的作用。

不同濃度Fe2+和Cu2+對靈芝不同發(fā)酵階段的生物量、多糖含量以及OPTs基因的轉(zhuǎn)錄表達有不同程度的影響。Fe2+處理促進靈芝生長，生物量增加；相反Cu2+抑制靈芝生長；兩種金屬離子在培養(yǎng)前期(15 d)對多糖合成有一定的抑制作用，而在后期(30 d)則表現(xiàn)為促進；OPTs基因在轉(zhuǎn)錄水平上對不同濃度Fe2+和Cu2+的響應(yīng)特征差異較大，其中不同濃度Cu2+處理下，培養(yǎng)前期OPTs基因表達水平較低，且差異不大，而培養(yǎng)后期表達水平較15 d的樣品明顯增加，且均存在差異；相反Fe2+質(zhì)量濃度為50 mg/L和400 mg/L，絕大多數(shù)OPTs基因在培養(yǎng)前期的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著提高。