李春蕊， 徐 敏， 宋志文， 梁滬蓮， 徐愛玲*

(1．青島理工大學 環(huán)境與市政工程學院，山東 青島 266033；2.青島市市容環(huán)境衛(wèi)生管理中心， 山東 青島 266073)

利用生物對有機廢棄物進行資源化處理已成為當今可持續(xù)發(fā)展的一個重要思路[1]。蚯蚓被認為是生態(tài)系統(tǒng)的工程師[2]，利用蚯蚓生物反應器實現(xiàn)有機廢棄物消解及資源化的研究及應用受到越來越多的關注。與其他處理方式相比，蚯蚓消解污泥、動物糞便和垃圾具有低成本、安全、高效等優(yōu)點，是現(xiàn)階段大規(guī)模低成本處理有機廢棄物行之有效的方法[3]。蚯蚓還可以用來調(diào)節(jié)土壤肥力、修復污染土壤、抑制蟲害與土傳病害等[4-7]。蚯蚓的生態(tài)功能與微生物密切相關，它可以通過調(diào)節(jié)微生物數(shù)量以及活性來影響對有機質(zhì)的分解[8]。研究表明，蚯蚓的腸道運轉(zhuǎn)顯著改變了基質(zhì)微生物群落組成[9]。蚯蚓的腸道微生物來自其所處環(huán)境，但與周圍環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)又存在較大差別，且蚯蚓能通過物理運動和排泄蚓糞改變環(huán)境微生物群落組成[10-11]。蚯蚓對周圍環(huán)境中微生物的影響包括直接效應[12-13]和間接效應[14]兩種方式。直接效應是指蚯蚓腸道通過對有機質(zhì)和微生物的攝取、消化、吸收，包括增加有機質(zhì)的表面積和改變微生物群落的構(gòu)成，來影響有機物的分解速率[15-16]；而間接效應是直接效應的延伸，包括蚓糞的熟化過程和蚓糞與基質(zhì)的混合，以及排泄出的蚓糞對周圍環(huán)境中微生物的影響，這個過程不需要蚯蚓的參與[17]。因此，了解基質(zhì)與蚓糞中微生物的變化與關系非常重要。 研究表明，在蚯蚓處理技術中，有機物的降解是在水溶性階段完成的，溶解性有機碳(Dissolved Organic Carbon，DOC)的含量決定微生物種群結(jié)構(gòu)和代謝類型[18]。本研究在構(gòu)建蚯蚓-污泥系統(tǒng)的基礎上，采用Illumina MiSeq高通量測序方法，研究外加葡萄糖、乳糖、淀粉、纖維素4種碳源對污泥和蚓糞的細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成的影響，對于揭示不同碳源影響下蚯蚓腸道與蚓糞、污泥微生物間的相互關系，闡明污泥中有機質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的微生物原理以及進一步研究蚯蚓的生態(tài)學功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蚯蚓 選用赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)，體長80 mm，體寬3～5 mm。

1.1.2 污泥 采自青島某人工濕地污水處理系統(tǒng)，污泥理化指標見表1。

表1 污泥基本理化指標

1.1.3 養(yǎng)殖裝置 采用HDPE周轉(zhuǎn)箱(長40 cm×寬20 cm×高20 cm)。每個養(yǎng)殖裝置內(nèi)污泥添加量500 g，均放入蚯蚓30 條。養(yǎng)殖裝置上部覆有紗網(wǎng)，養(yǎng)殖期間溫度(22±0.5) ℃，濕度65%。

1.1.4 主要儀器與設備 E. Z. N. A. Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA，美國)；微量核酸蛋白分析儀(Implen公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 碳源添加 將蚯蚓放入養(yǎng)殖裝置中養(yǎng)殖15 d，待其適應污泥環(huán)境后，在4 個養(yǎng)殖裝置中分別添加葡萄糖、乳糖、淀粉、纖維素各2 g，再養(yǎng)殖15 d，同時設置無外加碳源的對照組，養(yǎng)殖期滿30 d后分別提取實驗組和對照組污泥和蚓糞DNA。A0、A1、A2、A3、A4分別表示對照組和添加葡萄糖、乳糖、淀粉、纖維素實驗組的污泥樣品；B0、B1、B2、B3、B4分別表示對照組和添加葡萄糖、乳糖、淀粉、纖維素實驗組的蚓糞樣品。

1.2.2 樣品采集和總DNA提取 污泥采集選用分層、多點混合法，將采集的污泥樣品放置于滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌鑷子除去草根、碎石等，稱取0.8 g于滅菌的2 mL離心管中，用E. Z. N. A. Soil DNA Kit試劑盒提取細菌總DNA，放入冰箱中凍存?zhèn)溆谩?0 d實驗期結(jié)束后，從各養(yǎng)殖裝置中手工分離10 條健康蚯蚓，自來水洗凈污泥，用無菌水沖洗2～3次后放置于預先滅菌的培養(yǎng)皿，使蚯蚓在23 ℃恒溫培養(yǎng)箱中吞吐20～24 h，收集新鮮蚓糞，稱取0.8 g于滅菌的2 mL離心管中，采取與污泥樣品一致的方法提取細菌總DNA。利用微量核酸蛋白分析儀對分離純化后的DNA濃度與純度進行檢測，全部樣品DNA波長260/280值均在1.8～2.0間。檢測合格的基因組DNA樣品進行高通量測序。

1.2.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析 委托上海派森諾生物科技股份有限公司，利用Illumina MiSeq平臺對16S rRNA V3～V4區(qū)進行高通量測序。采用滑動窗口法對雙端的FASTQ序列做質(zhì)量過濾，利用軟件FLASH(version 1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/)[19]對通過質(zhì)量過濾的序列進行連接，對連接上的序列進行過濾和去除嵌合體，然后對得到的優(yōu)質(zhì)序列進行OTU聚類和注釋，繪制稀釋曲線(Rarefaction curve)，進行多樣性指數(shù)分析，并在不同分類水平上進行物種豐度差異分析和微生物群落結(jié)構(gòu)組成的統(tǒng)計分析。利用NCBI BLAST將查到菌種的信息與測序得到的微生物信息進行比對，對信息不全的細菌進行補充，然后分析細菌門、綱和OTU比例>0.1%優(yōu)勢種。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種豐度

2.1.1 OTU稀釋性曲線 圖1為各實驗組和對照組污泥和蚓糞稀釋曲線[20]。從圖1中可以看出，不同處理條件下污泥和蚓糞的稀釋曲線基本趨于平緩，表明每個樣品測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種，即測序量足夠。

圖1 污泥和蚓糞稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of sluge and vermicompost

2.1.2 Alpha多樣性分析 實驗組和對照組污泥和蚓糞的Alpha多樣性指數(shù)(Alpha diversity)[21]見表2。其中，Chao和ACE是常用于估算樣本物種豐度的指數(shù)，數(shù)值越大，表明樣品中的物種種類越多；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)[22]，Shannon指數(shù)越大，說明菌群多樣性越高，Simpson指數(shù)越小，說明菌群多樣性越高[23]。

表2 污泥和蚓糞樣品中Alpha多樣性指數(shù)

從表2結(jié)果可以看出，所有污泥樣品的Chao和ACE數(shù)值均明顯高于蚓糞樣品，說明污泥中細菌種類多于蚓糞，添加不同碳源的實驗組間污泥(A1～A4)Chao和ACE指數(shù)差別不大，但均高于對照組(A0)，說明添加碳源可增加污泥中細菌種類。添加葡萄糖(B1)、淀粉(B3)和纖維素(B4)實驗組間蚓糞的Chao和ACE指數(shù)相近且高于對照組(B0)，但乳糖(B2)實驗組Chao和ACE指數(shù)明顯低于對照組(B0)，說明添加乳糖可使蚓糞中細菌種類降低。Simpson和Shannon指數(shù)也得到與Chao和ACE相似的結(jié)果。

2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.2.1 門分類水平分析 污泥和蚓糞實驗組和對照組的細菌門水平分布情況見圖2，污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)分別檢測出22、20、20、21和20個門；蚓糞實驗組(B1～B4)和對照組(B0)分別檢測出15、13、15、17和15個門，數(shù)量均低于相應處理的污泥，其中乳糖組蚓糞(B2)門的數(shù)量低于對照組(B0)。 污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)檢測出的優(yōu)勢菌門基本相同，主要包括：變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和Saccharibacteriae。其中，所有樣品第一優(yōu)勢菌門均為變形菌門，相對豐度30.83%～55.45%，淀粉組(A3)最高，葡萄糖組(A1)最低。第二優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門，相對豐度14.20%～25.05%，對照組最高，淀粉組(A3)最低。另外，對照組(A0)中檢測到綠菌門(Chlorobi)，但實驗組中沒有檢測到。 蚓糞實驗組(B1、B3和B4)和對照組(B0)檢測到的優(yōu)勢菌門種類基本相同，包括：擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門和放線菌門；蚓糞乳糖組(B2)的優(yōu)勢菌門與其余組蚓糞相比種類減少，包括：變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和柔膜菌門(Tenericutes)。葡萄糖組(B1)、淀粉組(B3)、纖維素組(B4)和對照組(B0)第一優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門，相對豐度41.34%～65.45%，對照組最高(B0)，淀粉組(B3)最低，第二優(yōu)勢菌門均為變形菌門，相對豐度16.29%～33.32%，淀粉組(B3)最高，葡萄糖(B1)組最低。而乳糖組(B2)第一優(yōu)勢菌門則為變形菌門，相對豐度為83.96%，第二優(yōu)勢菌門為擬桿菌門，相對豐度7.44%，另外，乳糖組(B2)檢測到柔膜菌門(Tenericutes)，相對豐度為2.60%，其他實驗組和對照組均未檢出。

圖2 污泥和蚓糞門分類水平上的微生物群落組成Fig.2 Microbial community composition of sludge and vermicompost at phylum level

2.2.2 綱分類水平分析 污泥和蚓糞實驗組和對照組細菌綱水平的分布情況見圖3。污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)分別檢測到43、41、42、43和32個綱，實驗組(A1～A4)綱的數(shù)量均高于對照組(A0)；蚓糞實驗組(B1～B4)和對照組(B0)分別檢出29、19、35、30和23個綱，數(shù)量低于相應污泥，其中蚓糞乳糖組(B2)綱的數(shù)量低于對照組(B0)，其他實驗組(B1、B3和B4)綱的數(shù)量則高于對照組(B0)。 污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)中檢測到的優(yōu)勢菌綱基本相同，主要包括：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽胞桿菌綱(Bacilli)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、放線菌綱(Actinobacteria)、噬纖維菌綱(Cytophagia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、Dehalococcoidia、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、Gemmatimonadales和Micrococcales。其中，實驗組(A1～A4)的前兩位優(yōu)勢菌綱均為γ-變形菌綱和芽胞桿菌綱，γ-變形菌綱相對豐度分別為14.35%～4615%，芽胞桿菌綱相對豐度10.60%～20.21%；對照組(A0)第一優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱，相對豐度16.60%，其余9個菌綱相對豐度相似，范圍為6%～8%。 蚓糞實驗組(B1、B3和B4)與對照組(B0)中優(yōu)勢菌綱基本相同，但與污泥存在較大差異。主要包括：黃桿菌綱、γ-變形菌綱、芽胞桿菌綱、噬纖維菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)、鞘脂桿菌綱和β-變形菌綱；蚓糞乳糖組(B2)與其余組蚓糞相比優(yōu)勢菌綱減少的種類較多，此組蚓糞的優(yōu)勢菌綱有γ-變形菌綱、黃桿菌綱、芽胞桿菌綱、鞘脂桿菌綱和柔膜菌綱(Mollicutes)。其中，葡萄糖組(B1)、淀粉組(B3)、纖維素組(B4)和對照組(B0)的第一優(yōu)勢菌綱和第二優(yōu)勢菌綱均為黃桿菌綱和γ-變形菌綱，而蚓糞乳糖組(B2)第一優(yōu)勢菌綱和第二優(yōu)勢菌綱則為γ-變形菌綱和黃桿菌綱，相對豐度分別為83.08%和6.53%，另外，蚓糞乳糖組(B2)檢測到柔膜菌綱(Mollicutes)，相對豐度2.60%，其他實驗組和對照組均未檢出。

圖3 污泥和蚓糞綱分類水平上的微生物群落組成Fig.3 Microbial community Composition of sludge and vermicompost at classes level

2.2.3 優(yōu)勢屬種分析 對污泥和蚓糞實驗組和對照組細菌的優(yōu)勢屬種(OTU比例超過0.1%的細菌序列)進行分析，結(jié)果見圖4。污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)中優(yōu)勢屬種分別為58、59、58、58和50個，實驗組優(yōu)勢屬種數(shù)量均高于污泥對照組；蚓糞實驗組(B1～B4)和對照組(B0)樣品優(yōu)勢屬種分別為55、47、56、58和49個，乳糖實驗組(B2)優(yōu)勢屬種數(shù)量低于蚓糞對照組，其他實驗組優(yōu)勢屬種數(shù)量則高于蚓糞對照組。 污泥實驗組(A1～A4)和對照組(A0)相對豐度較大的優(yōu)勢屬種包括Lactococcuspiscium、Bacillustoyonensis、Enterococcushirae、Dehalogenimonasalkenigignens、Thermomarinilinealacunifontana、Pseudomonasguineae和Flavobacteriumtructae。雖然實驗組添加的碳源不同，但不同實驗組中部分優(yōu)勢屬種相對豐度與對照組相比出現(xiàn)類似變化，如T.lacunifontana相對豐度降低，F(xiàn).tructae和P.vancouverensis相對豐度增加，同時有些實驗組出現(xiàn)特有優(yōu)勢屬種，如乳糖組(A2)的F.reichenbachii(7.02%)、淀粉組(A3)的Alkanindigesillinoisensis(5.73%)和Zobellellataiwanensis(4.34%)、纖維素組(A4)的Cellvibriogandavensis(5.15%)等。 蚓糞葡萄糖組(B1)、淀粉組(B3)、纖維素組(B4)和對照組(B0)共有的相對豐度較大的優(yōu)勢屬種包括F.resistens、F.tructae、Shewanellaputrefacien、Paracoccusaminophilus、P.guineae、F.hibernum、Chryseobacteriumculicis、L.piscium、B.toyonensis、E.hirae、Algoriphaguschungangensis、Arenimonasdaejeonensis、Phycisphaeramikurensis。蚓糞乳糖組(B2)優(yōu)勢屬種與其余組差異明顯，前兩位優(yōu)勢屬種為Aeromonaspopoffii(40.96%)和A.rivipollensis(31.58%)，相對豐度之和>70%，第三優(yōu)勢屬種為F.reichenbachii(3.26%)。另外，淀粉實驗組出現(xiàn)的特有優(yōu)勢屬種有A.illinoisensis(7.80%)、Z.taiwanensis(2.36%)和Lacunisphaeraanatis(4.62%)，纖維素實驗組出現(xiàn)的特有優(yōu)勢屬種為C.gandavensis(4.69%)。 盡管污泥實驗組(A1～A4)與蚓糞實驗組(B1～B4)優(yōu)勢屬種存在明顯差異，但在添加同一碳源的污泥和蚓糞實驗組中都能發(fā)現(xiàn)相同的優(yōu)勢屬種，如葡萄糖組污泥(A1)和蚓糞(B1)的F.tructae和L.piscium，乳糖組污泥(A2)和蚓糞(B2)的F.reichenbachi，淀粉組污泥(A3)和蚓糞(B3)的A.illinoisensis和Z.taiwanensis以及纖維素組污泥(A4)和蚓糞(B4)的C.gandavensis。

圖4 污泥和蚓糞優(yōu)勢菌種的相對豐度Fig.4 The most abundant bacterial at genus lever in sludge and vermicompost

3 討 論

蚯蚓腸道內(nèi)的生物化學反應相當復雜，不同微生物對腸道環(huán)境反應存在差異[24-25]。通過蚯蚓腸道加工后，土壤中微生物區(qū)系和群體數(shù)量發(fā)生顯著變化[26]，有些細菌在通過腸道的過程中被激活，一些不受影響，另外一些數(shù)量減少[27-28]，同時蚯蚓存在自己的腸道微生物或者共生體[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓-污泥系統(tǒng)中污泥與蚓糞細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，蚓糞的Chao和ACE指數(shù)低于污泥，蚓糞的細菌種類明顯少于污泥的細菌種類，并且蚓糞的優(yōu)勢菌門、菌綱和優(yōu)勢屬種的組成與相應的污泥相比均發(fā)生一定變化，酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門以及酸桿菌綱、厭氧繩菌綱和芽單胞菌綱在污泥中相對豐度較大，但在蚓糞中明顯降低，而疣微菌門在除乳糖組(B2)的其他組蚓糞中相對豐度增加，揭示了蚯蚓腸道對微生物群落具有調(diào)節(jié)作用。

Knapp等[30]在蚯蚓L.Rubellus腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與攝取食物來源無關的γ-變形菌，K?nig等[31]報道變形菌門尤其是γ-變形菌綱在土壤無脊椎動物體內(nèi)大量存在。從本研究結(jié)果看，污泥及蚓糞實驗組和對照組中γ-變形菌綱均為絕對優(yōu)勢菌綱，但與污泥相比，除蚓糞乳糖組(B2)與纖維素組(B4)外，其他蚓糞實驗組和對照組中γ-變形菌綱相對豐度均有所降低，乳糖組(B2)大幅提高了36.93%，纖維素組(B4)則提高3.31%。添加不同碳源會使蚓糞細菌多樣性發(fā)生變化，除乳糖組(B2)細菌多樣性降低外，其余蚓糞實驗組的細菌多樣性均增加，且不同碳源系統(tǒng)的蚓糞細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。另外，在屬種水平上，蚓糞乳糖組(B2)也表現(xiàn)出與其他組存在差異。蚓糞乳糖組(B2)檢測出柔膜菌門，在其他樣品中均未發(fā)現(xiàn)，柔膜菌門營養(yǎng)要求苛刻，推測原因與添加乳糖后蚯蚓腸道環(huán)境變化有關。

與本研究結(jié)果不同，Gomez-Brandon等[32-33]用不同食物(牛糞、馬糞、豬糞)喂食蚯蚓(E.andrei)，發(fā)現(xiàn)食物通過腸道后，呈現(xiàn)總微生物量減少、細菌數(shù)量減少、真菌數(shù)量沒有變化的情況，但食源不同的蚓糞中微生物群落結(jié)構(gòu)并沒有顯著差異；用不同食物(牛糞、馬糞、兔糞)喂食3種蚯蚓(E.andrei、E.fetida、Perionyxexcavatus)1個月，蚓糞中細菌群落結(jié)構(gòu)也沒有顯著性差異。分析原因可能為，盡管牛糞、馬糞、兔糞來源不同，但其基本有機物質(zhì)組成類似，而本研究碳源中淀粉和纖維素經(jīng)酶水解后都產(chǎn)生葡萄糖單體，所以其在蚯蚓體內(nèi)的生化反應過程與葡萄糖類似，但參與乳糖代謝的酶多為誘導酶，并且部分細菌不能直接利用乳糖作為碳源和能源，導致蚯蚓腸道內(nèi)乳糖代謝過程與葡萄糖存在較大差異，從而進一步影響污泥和蚓糞的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

蚯蚓腸道對微生物的群體結(jié)構(gòu)及生物活性的調(diào)節(jié)作用可提高特定微生物種群的繁殖速度及呼吸代謝活性，在一定程度上也強化微生物降解有機物的作用，提高有機物的降解效率[34-35]。蚯蚓腸道絕對優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和變形菌門，Bernard等[36]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門在有機物分解過程中起著關鍵作用，可為某些特定細菌提供生長介質(zhì)，并且賦予它們特定的分解能力分解有機物。變形菌門被認為是頑固有機物如木質(zhì)纖維素的有效降解者[37]。研究發(fā)現(xiàn)，添加不同碳源的同一組污泥與蚓糞中都檢出適應特定碳源的細菌類型。如污泥和蚓糞葡萄糖實驗組中L.piscium相對豐度高于其他實驗組，L.piscium為革蘭陽性球菌，10～25 ℃條件下生長繁殖快，能發(fā)酵葡萄糖；污泥和蚓糞乳糖實驗組中F.reichenbachii相對豐度高于其他實驗組，F(xiàn).reichenbachii為革蘭陰性菌，適宜生長溫度20～34 ℃，可產(chǎn)生水解乳糖的酶；污泥和蚓糞淀粉實驗組中A.illinoisensis和Z.taiwanensis相對豐度明顯高于其他實驗組，有研究表明Z.taiwanensis能夠通過異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用去除廢水中氨氮[38]；污泥和蚓糞纖維素實驗組中C.gandavensis相對豐度高于其他實驗組，C.gandavensis是一種能降解纖維素的中溫好氧菌。