王世偉， 王卿惠， 翟麗萍， 劉 軍， 于志丹

(1．齊齊哈爾大學(xué) 生命與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161005;2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)屬革蘭陽性菌，不僅具有廣泛抑真菌特性，而且能產(chǎn)生多種重要的酶類。因此，在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治、環(huán)保、食品安全等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。本文對解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的蛋白酶、多糖降解酶、脂類代謝酶和其他相關(guān)重要酶類及其應(yīng)用進行綜述。

1 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的分解蛋白質(zhì)的酶類

蛋白酶(Proteinase)是工業(yè)中占最大比例的酶類，約占全世界每年總銷售量的60%。微生物蛋白酶均為胞外酶，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要研究和應(yīng)用價值[1]。解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的蛋白酶包括中性蛋白酶(Neutral proteinase)、堿性蛋白酶(Alkaline protease)、耐受性蛋白酶(Tolerance protease)和專一性蛋白酶(Specific protease)等，深入研究其蛋白酶特性，對提高酶產(chǎn)量和質(zhì)量進而將其應(yīng)用于相關(guān)科研領(lǐng)域具有重要價值。

1.1 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶

中性蛋白酶(Neutral proteinase)不但廣泛應(yīng)用于動植物蛋白水解、高級調(diào)味品制取和食品營養(yǎng)強化劑生產(chǎn)，還常用于皮革脫毛、軟化、羊毛絲綢脫膠等加工行業(yè)[2-3]。Wang等[4]為了提高中性蛋白酶表達水平，從解淀粉芽胞桿菌K11菌株中克隆了編碼中性蛋白酶基因Banpr，在枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)WB 600中構(gòu)建了含有Banpr基因的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化菌株K11，篩選到具有最高蛋白酶活性的陽性轉(zhuǎn)化菌110N-6。經(jīng)100多次傳代后，該菌仍具有很強的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，酶活性達(8 995±250) U/mL，高于原始出發(fā)菌株和枯草芽胞桿菌AS.1398。可見,利用基因工程方法提高解淀粉芽胞桿菌中性蛋白酶產(chǎn)量和質(zhì)量，有望在食品和毛皮加工領(lǐng)域得以更好應(yīng)用。

1.2 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶

堿性蛋白酶(Alkaline protease)在pH值偏堿性范圍內(nèi)可有效水解蛋白質(zhì)肽鍵，在食品、洗滌及制革等行業(yè)中具有很高研究和應(yīng)用價值[5]。解淀粉芽胞桿菌SP1產(chǎn)生的胞外堿性蛋白酶具有很強耐熱性。Guleria等[6]發(fā)現(xiàn)SP1菌株產(chǎn)生的蛋白酶是一種分子量為43 kDa的單聚體，在60 ℃堿性環(huán)境下活力最佳，在沒有化學(xué)助劑的情況下仍具有極好地親和性和催化能力，甚至在接觸表面活性劑和氧化劑的情況下仍能保持穩(wěn)定。其蛋白酶是一種胞外堿性蛋白酶，能抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)生長。Guleria等[7]使用不同濃度藻酸鈣、瓊脂和聚丙烯酰胺對該蛋白酶進行了固定化，固定化酶可重復(fù)利用。角蛋白(keratins)普遍存在于羽毛、頭發(fā)和羊毛中，其分子間存在高度交聯(lián)的鹽鍵、氫鍵、二硫鍵和其他交聯(lián)鍵，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，普通消化酶難以將其有效降解，造成環(huán)境污染。生物降解角蛋白具有反應(yīng)過程高效、節(jié)能、不易造成環(huán)境污染的優(yōu)點，而且反應(yīng)條件溫和、降解產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿蜆O高實用性[8]。角蛋白酶(Keratinase)屬專一降解角蛋白的誘導(dǎo)酶，只有當(dāng)環(huán)境中存在角蛋白(誘導(dǎo)子)時才會合成。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌菌株K11具有明顯羽毛降解能力(在24 h內(nèi)完全降解羽毛)，能產(chǎn)堿性角蛋白酶。該角蛋白酶編碼基因kerk在枯草芽胞桿菌SCK6中過表達。純化的重組角蛋白kerk在50 ℃和pH 11.0下表現(xiàn)出最佳活性，存在DTT(Dithiothreitol,二硫蘇糖醇)下0.5 h內(nèi)能迅速降解整個羽毛。從枯草芽胞桿菌SCK6中提取含有該蛋白酶基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化解淀粉芽胞桿菌K11。重組解淀粉芽胞桿菌K11在12 h內(nèi)降解羽毛能力明顯增強，反應(yīng)時間大大縮短，酶活性(1 500 U/mL)提高6倍。這種高效、快速羽毛降解能力在羽毛粉制備和廢棄羽毛處理方面具有潛在應(yīng)用前景。Guleria等[10]從SP1菌株基因組中克隆了堿性蛋白酶基因，該基因由1 149 bp核苷酸組成，能編碼382個氨基酸，酶蛋白分子量為43 kDa。該蛋白酶基因在大腸埃希菌BL21中表達，獲得的蛋白酶在pH 8.0和60 ℃條件下活性最佳。使用基于拉(氏)圖(α-碳與酰胺平面交角圖)的Phyre2服務(wù)器確定了該堿性蛋白酶三維結(jié)構(gòu)，為深入研究該堿性蛋白酶的性質(zhì)及商業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。筆者使用同源模建和底物對接方法研究了RhodococcusruberCGMCC3090腈水合酶空間結(jié)構(gòu)和催化機制，初步闡明了該腈水合酶的底物特異性和寬泛性的作用機制，為該腈水合酶的蛋白質(zhì)工程提供了科學(xué)數(shù)據(jù)[11]。由此可見，對解淀粉芽胞桿菌蛋白酶進行固定化，構(gòu)建基因工程菌株提高蛋白酶表達水平，使用“同源模建”預(yù)測酶蛋白三維結(jié)構(gòu)深入研究酶的催化機理，將使解淀粉芽胞桿菌蛋白酶在食品、洗滌和制革等領(lǐng)域得到更好應(yīng)用。

1.3 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的耐受性蛋白酶

耐受性蛋白酶(Tolerance protease)在理論和應(yīng)用上具有重要意義，已成為眾多學(xué)者研究的熱點。一些微生物蛋白酶對多種金屬離子、有機溶劑及表面活性劑均有較好耐受性[12]。解淀粉芽胞桿菌蛋白酶對離子液，甚至有機溶液具有良好耐受性。Kurata等[13]研究發(fā)現(xiàn)分離于日本豆醬的解淀粉芽胞桿菌CMW1能耐離子液，在10% (體積分?jǐn)?shù)) 1-丁基-3-甲基咪唑氯化物、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鈉等親水性離子液體中生長良好。該菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶(BapIL)，在80%(體積分?jǐn)?shù))上述離子液中活性仍能保持穩(wěn)定。該蛋白酶還能耐受其他多種離子液，在pH 4.0～12.6范圍內(nèi)或在4 004 mmol/L NaCl溶液中其活性均保持穩(wěn)定。特別是該酶在50%(體積分?jǐn)?shù)) 親水和疏水性有機溶液中也具有活性，耐受性蛋白酶在工業(yè)上有重要的應(yīng)用價值。袁久剛等[14]為提高羊毛表面親水性，使用對羊毛角蛋白具有良好溶解能力的離子液體(氯化1-丁基-3-甲基咪唑)預(yù)處理羊毛蛋白，將離子液體預(yù)處理和蛋白酶處理相結(jié)合，完成了對羊毛表面的親水化改性。經(jīng)過這種“聯(lián)合”處理，織物潤濕時間下降，纖維吸水量增加，織物表面自由能降低?？梢姡x子液體預(yù)處理可以有效促進蛋白酶對纖維的水解能力，預(yù)處理后纖維表層親水性基團增加，織物潤濕性能提高，在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的優(yōu)勢。

1.4 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的纖溶酶和凝乳酶

解淀粉芽胞桿菌還能生產(chǎn)纖溶酶(Plasmin)和凝乳酶(Chymosin)等重要的專一性蛋白酶。在環(huán)境保護、醫(yī)療行業(yè)以及奶酪加工領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。纖溶酶能專一降解纖維蛋白，是纖溶系統(tǒng)的重要組分。隨著血栓性疾病臨床死亡率的增加，研制開發(fā)新型溶血栓藥物已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點[15]。Yogesh等[16]純化了分離于多薩面糊的解淀粉芽胞桿菌MCC2606菌株生產(chǎn)的對纖維蛋白具有偏愛性的纖溶酶，該纖溶酶(CFR15)分子量為32 kDa，具有溶解纖維蛋白和纖維蛋白原的水解活性；在鎂離子存在的情況下，酶活性顯著提高。初始降解產(chǎn)物MS/MS分析表明，在4條纖維蛋白鏈中，纖維蛋白β鏈?zhǔn)荂FR15蛋白酶早期作用的主要成分和位點，顯然CFR15-蛋白酶在醫(yī)藥工業(yè)上可作為一種具有潛力的纖維蛋白溶解劑。Ochoa等[17]研究了解淀粉芽胞桿菌FCF-11無毒、可直接作用的纖溶酶，在試管內(nèi)外評估了其溶栓效果。研究發(fā)現(xiàn)純酶分子量為18.2 kDa，該蛋白酶的Ip為0±0.2，純化后比酶活增加了443.5倍，產(chǎn)率達17%。乙二胺四乙酸和兩種金屬酶抑制劑(吡啶和鄰菲啰啉)對酶活性沒有影響，酶對發(fā)色底物S-2586有很高特異性。該酶在試管內(nèi)可直接作用于血栓，可使凝血時間延長4.1倍。該酶溶栓性能好，分子量低，對其他血漿蛋白無特異性，可作為更安全的溶栓藥物?？梢姡獾矸垩堪麠U菌產(chǎn)生的溶栓酶具有良好的特性，對血栓性疾病治療具有重要潛力。

凝乳酶最早在未斷奶小牛胃中發(fā)現(xiàn)，是一種天門冬氨酸蛋白酶，是奶酪工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵酶，從動物組織提取明顯不足[18]。通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)凝乳酶更具有顯著優(yōu)勢，是解決酶源、降低成本的有效途徑[19]。凝乳酶可專一切割乳中κ-酪蛋白Phe105～Met106之間肽鍵，破壞酪蛋白從而使牛奶凝結(jié)，對奶酪質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味形成至關(guān)重要。Zhang等[20]為了提高凝乳酶產(chǎn)量，在深層發(fā)酵中使用麥麩為營養(yǎng)源，應(yīng)用兩種統(tǒng)計學(xué)方法優(yōu)化了解淀粉芽胞桿菌D4的培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)初始pH、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間顯著影響D4菌株凝乳酶產(chǎn)量，使用Box-Behnken獲得優(yōu)化條件，凝乳酶產(chǎn)量顯著提高，活性達到1 996.9 SU/mL，比初始反應(yīng)條件下提高2.92倍。由于解淀粉芽胞桿菌屬于益生菌，安全性好，因此將其產(chǎn)生的凝乳酶應(yīng)用于奶酪工業(yè)具有十分廣闊的前景。

2 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的分解多糖的酶類

2.1 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的淀粉酶

淀粉酶(Amylase)能催化水解淀粉分子內(nèi)糖苷鍵，是能水解淀粉和糖原的酶的總稱。一般以淀粉水解產(chǎn)物異頭碳的構(gòu)型劃分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。目前已有多種淀粉酶被成功商業(yè)化,廣泛應(yīng)用于水解織物上淀粉漿料，提高果汁加工中的過濾速度；還可用于蔬菜加工、糖漿制造、葡萄糖生產(chǎn)及加工領(lǐng)域。解淀粉芽胞桿菌淀粉酶作用底物豐富，在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯優(yōu)勢。Deb等[21]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌P-001胞外淀粉酶可受不同淀粉底物誘導(dǎo)，玉米粉是最佳底物；對熱、堿、表面活性劑、氧化劑和漂白劑均具有很強耐受性(Thermostable amylase)。Prajapati等[22]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌KCP2能產(chǎn)熱耐受性和嗜堿α-淀粉酶。Du等[23]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌BH072產(chǎn)生的α-淀粉酶分子量68 kDa，N-端10個氨基酸為NSGLNGYLTH，對多種試劑均具有很好的耐受性；在表面活性劑、氧化劑和漂白劑存在下仍能保持穩(wěn)定。為了研究解淀粉芽胞桿菌耐受性產(chǎn)生的機制，Montor-Antonio等[24]克隆表達了解淀粉芽胞桿菌JJC33的α-淀粉酶(MAmyJ33)基因。研究發(fā)現(xiàn)重組α-淀粉酶(AmyJ33r)分子量(72 kDa)比野生α-淀粉酶 (AmyJ33)高出25 kDa，正是由于野生酶和重組酶內(nèi)部C-末端加工方式才導(dǎo)致其分子量的差異。與野生酶相比，重組酶C-端額外一個區(qū)域嚴(yán)重影響酶的活性、特異性和生化行為，使酶失去了水解原料淀粉的活性，但增加了酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，更改了對堿性pH活力圖譜。推測重組酶AmyJ33r催化結(jié)構(gòu)域因受酶C-端額外區(qū)域氨基酸的干擾和阻礙，使酶特性發(fā)生改變?？梢娡ㄟ^基因重組方法，研究酶蛋白的結(jié)構(gòu)域的差異，對更好地改造酶的結(jié)構(gòu)，獲得更有適應(yīng)性的耐受性淀粉酶具有重要意義。為了提高解淀粉芽胞桿菌淀粉酶的熱耐受性，Wang等[25]用BAA蛋白表達模仿策略，通過比較不同基因 (mpfa和opfa)、啟動子(PamyA和P43)和菌株(F30、F31、F32和F30-△amyA)，在解淀粉芽胞桿菌中成功表達嗜熱古細(xì)菌的PFA(α-amylase from pyrococcus furiosus,嗜熱古細(xì)菌α-淀粉酶)，最終酶活達2 714 U/mL。在大約100 ℃和pH 5下重組PFA不需要Ca2+就能保持活性和穩(wěn)定性；在100 ℃保持4 h仍保留80%酶活?？梢?，將不同優(yōu)勢淀粉酶進行組合十分重要，酶的耐受性和酶的結(jié)構(gòu)是相關(guān)的，酶蛋白上的特定氨基酸結(jié)構(gòu)是其產(chǎn)生不同“耐受性”的基礎(chǔ)，因此分析耐受性淀粉酶的結(jié)構(gòu)與耐受性關(guān)系具有重要價值。

2.2 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的纖維素酶

纖維素酶(Cellulase)能夠水解纖維素的β-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，其作用的底物比較復(fù)雜。它不是單體酶而是由起協(xié)同作用多組分酶系組成的復(fù)合酶，其中各組分功能也存在差異[26]。在纖維素酶系中，內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4)是主要成分。Singh等[27]研究了解淀粉芽胞桿菌SS35，發(fā)現(xiàn)其eglS基因能編碼屬于糖基水解酶家族5的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶。Fan等[28]構(gòu)建了eglS基因中斷突變菌株，以研究其在植物中的適應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，eglS基因失活突變子TB2k胞內(nèi)纖維素酶活性明顯減少，說明內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶有利于解淀粉芽胞桿菌種群在植物體內(nèi)定殖。耐受性纖維素酶(Tolerant cellulase)具有重要應(yīng)用價值，解淀粉芽胞桿菌纖維素酶對熱、酸、鹽等具有明顯的耐受性。Ye等[29]發(fā)現(xiàn)分離于鵝盲腸的解淀粉芽胞桿菌S1產(chǎn)生的纖維素酶是一種天然纖維素酶，對熱、酸具有明顯抗性。解淀粉芽胞桿菌S1纖維素酶具有很強抗熱和抗鹽活性。Sun等[30]將該菌編碼纖維素酶的基因克隆并在大腸埃希菌中表達。該基因全長1 500 bp，編碼55 kD蛋白質(zhì)。Irfan等[31]研究了分離于巴基斯坦克什米爾的塔塔帕尼溫泉的解淀粉芽胞桿菌AK9，純化于該菌株的纖維素酶在50～70 ℃寬泛溫度內(nèi)仍保留活性，在60 ℃和pH 5.0條件下穩(wěn)定性最高；在存在非離子表面活性劑、不同金屬離子和水不溶性有機溶液情況下，該酶也很穩(wěn)定。可見，在理論和實際應(yīng)用中，耐受性纖維素酶的研究都具有重要意義。

2.3 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的木聚糖酶

木聚糖水解酶系(Xylanolytic enzyme systems)是一類降解木聚糖的酶系。其中關(guān)鍵水解酶β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶能水解木聚糖分子中β-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖、木二糖等低聚木糖以及少量木糖和阿拉伯糖；而其中的β-木糖苷酶則水解低聚木糖末端，釋放木糖殘基。另外，參與徹底降解木聚糖的還有其他酶類，它們作用于木糖與側(cè)鏈取代基之間的糖苷鍵，協(xié)同主鏈水解酶最終將木聚糖轉(zhuǎn)化為單糖。Amore等[32]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌XR44A能生產(chǎn)木聚糖酶，活力高達10.5 U/mL。通過酶譜法和蛋白組學(xué)組合分析，發(fā)現(xiàn)該酶屬于β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶。在酒糟糖發(fā)酵期間，具有木聚糖酶活性的解淀粉芽胞桿菌培養(yǎng)液上清能產(chǎn)生約43%木糖。Liu等[33]在AOX1啟動子控制下在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中高效表達了編碼解淀粉芽胞桿菌木聚糖酶A (BaxA)基因BaxA，使用鎳-親和樹脂柱層析將重組木聚糖酶(rePBaxA)純化為同質(zhì)。重組木聚糖酶rePBaxA是一種具有轉(zhuǎn)糖基活力的內(nèi)切木聚糖酶，可降解山毛櫸木材和山毛櫸木聚糖釋放木糖-木六糖(X1-X6)混合物，其中木二糖(X2)和木三糖(X3)為主要產(chǎn)物。Kumar等[34]研究了解淀粉芽胞桿菌SK-3菌株木聚糖酶的特性，純化的酶分子量為50 kDa。在不同酸性環(huán)境下仍保留很高活性，例如紫丁香酸 (無損失)、肉桂酸(97%保留)、苯甲酸(94%保留)和酚(97%保留)，該酶對酚醛塑料也表現(xiàn)良好耐受性。Xu 等[35]為了提高木聚糖酶特性以滿足工業(yè)應(yīng)用需要，通過易錯PCR方法對編碼解淀粉芽胞桿菌的木聚糖酶A的baxA基因進行突變，從基因文庫中篩選到突變子pCbaxA50。序列比對揭示由pCbaxA50質(zhì)粒產(chǎn)生的重組木聚糖酶內(nèi)有一致突變位點S138T。純化重組酶的比酶活為9.38 U/mg，比在大腸埃希菌 BL21(DE3)親本菌株中表達的reBaxA高3.5倍。在熱和極端的pH處理時reBaxA50比reBaxA更穩(wěn)定?？梢?，通過定點突變方法可以獲得更具耐受性的菌株，在實際生產(chǎn)中更具有應(yīng)用價值。

3 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的與酯類代謝有關(guān)的酶

3.1 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肪酶

脂肪酶(Lipase)屬于羧基酯水解酶類，能逐步將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酸廣泛應(yīng)用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面。Saengsanga等[36]從富含油脂的食物垃圾中分離到淀粉芽胞桿菌E1PA，該菌能產(chǎn)生一種需要植物油誘導(dǎo)的脂肪酶。該脂肪酶在異源大腸埃希菌宿主中被成功表達，純化的脂肪酶氨基酸序列中108～112位具有保守五肽殘基序ala-his-ser-met-gly。重組脂肪酶能水解多種?；?C4-C18)，但以肉豆蔻酸對硝基苯基酯(C14)為最佳底物。該脂肪酶與已報導(dǎo)的B.amyloiquefaciens脂肪酶(脂肪酶亞家族I.4)結(jié)構(gòu)相似；但同亞家族I.5(約43 kDa，pi 6)脂肪酶的結(jié)構(gòu)差異顯著。重組型和野生型脂肪酶E1PA均能以相似水平消化富含脂質(zhì)的食物垃圾，在工業(yè)上可作為生產(chǎn)生物柴油的酶制劑。Kanmani等[37]在大腸埃希菌DH5α中克隆、表達和測序了解淀粉芽胞桿菌PS35脂肪酶基因。重組酶對長鏈帕拉膠-硝基苯酯(底物)具有偏愛性，因此具有典型脂肪酶特征。在不同化學(xué)調(diào)節(jié)劑存在時，酶表現(xiàn)出頑強的殘余活性。有趣的是，有機溶劑(正己烷和甲苯)也有利于該酶活性的發(fā)揮，因此在工業(yè)應(yīng)用更加理想[31]。生物柴油是典型的“綠色能源”，是由植物油、動物油、廢棄油脂或微生物油脂與甲醇或乙醇經(jīng)酯轉(zhuǎn)化而形成的脂肪酸甲酯或乙酯。Cai等[38]使用富集培養(yǎng)方法從臭豆腐鹽水中分離出解淀粉芽胞桿菌Nsic-8，經(jīng)同源性分析獲得該菌株脂類代謝關(guān)鍵酶基因，命名為lipBAi，推導(dǎo)出的脂肪酶氨基酸序列與解淀粉芽胞桿菌IT-45具有高度一致性，屬于三酰甘油脂肪酶。使用質(zhì)粒pET-28a在大腸埃希菌BL21(DE3)表達了該脂肪酶基因。重組酶LipBA在pH 7.0～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，但在堿性條件下更加穩(wěn)定。以棕櫚酸對硝基苯酯為底物，純化的LipBA酶的Km和Vmax分別為(1.04±0.06) mmol/L 和(119.05±7.16)μmol/(mL·min)，可見繼續(xù)研究和開發(fā)該重組酶將在生物柴油的生產(chǎn)上具有廣闊前景。

3.2 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的酯酶

酯酶(Esterase)是一類催化酯鍵水解和合成的酶類。水解時催化酯鍵產(chǎn)生甘油和脂肪酸；合成時把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，產(chǎn)物為酯類及其他芳香類物質(zhì)。解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的酯酶(BAE)合成手性藥物中間體(R)-1-(3′,4′亞甲二氧基苯基)乙酸乙酯。Liu等[39]通過蛋白質(zhì)工程提高了BAE的區(qū)域選擇性。獲得的工程變株V10 (K358D/A396C) 具有極好的區(qū)域選擇性，同時酶的活性并未因此改變。研究發(fā)現(xiàn)突變的酯酶BAE的區(qū)域選擇性是因K358D 和A396C突變位點協(xié)作效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果。使用變種酯酶V10能很容易地制備區(qū)域純度的(R)-1-(3′,4′-亞甲二氧基苯基)乙醇，ee值>97%?？梢娫摴こ袒孽ッ冈谑中运幬锖铣芍芯哂袘?yīng)用潛力。Fengying等[40]研究了解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的高化學(xué)和區(qū)域選擇性脂酶產(chǎn)氯霉素酯的合成途徑。使用克隆于解淀粉芽胞桿菌的酯酶LipBA將氯霉素和不同碳鏈長度的供體合成一系列氯霉素酯。可見，解淀粉芽胞桿菌酯酶的開發(fā)和利用有著廣闊的前景。

4 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的漆酶、植酸酶及柚苷酶

4.1 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的漆酶

漆酶(Laccase)是一種含4個銅離子的多酚氧化酶(ρ-二元酚氧化酶，EC1.10.3.2)，屬于單體糖蛋白形式存在的銅藍(lán)氧化酶。漆酶發(fā)生反應(yīng)后唯一產(chǎn)物就是水，本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素。漆酶作為高效的生物檢測器已成為底物、輔酶、抑制劑等分析的有效生物檢測工具。一般真菌漆酶在pH 4.0以上時不能作用染料活性藍(lán)52底物，并在>45 ℃下迅速失活。Nikola等[41]從塞爾維亞工農(nóng)業(yè)土壤中分離出100株野生型芽胞桿菌，其中有3株菌株對ABTS顯示了漆酶活性。在大腸埃希菌中對其中1株解淀粉芽胞桿12B漆酶基因進行了克隆，獲得的重組漆酶甚至在pH 7.0和pH 4.0以及高溫下也能降解染料活性藍(lán)52。Chen等[42]對1株解淀粉芽胞桿菌漆酶基因在畢赤酵母中進行克隆和細(xì)胞外表達。重組漆酶能以高活性分泌于培養(yǎng)上清。盡管酶在610 nm處缺乏藍(lán)色漆酶典型的吸收條帶，但電子順磁共振 (EPR)譜證明漆酶內(nèi)部存在1型銅中心，這種結(jié)構(gòu)在紫外和可見光譜中并未發(fā)現(xiàn)。金屬含量分析揭示酶的每個蛋白質(zhì)分子都包含2個銅離子、1個鐵離子和1個鋅離子，因此確定該酶是一種新的非藍(lán)色漆酶。純漆酶對底物額黑5和靛藍(lán)具有高效脫色能力，在1 h后脫色率達93%。解淀粉芽胞桿菌重組漆酶優(yōu)良特性使其在工業(yè)應(yīng)用上比大多數(shù)漆酶可能更有優(yōu)勢。解淀粉芽胞桿菌漆酶比真菌漆酶在降解相關(guān)底物時更具優(yōu)勢，充分挖掘解淀粉芽胞桿菌的漆酶資源，將在工業(yè)和環(huán)境保護領(lǐng)域發(fā)揮更大的優(yōu)勢。

4.2 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的植酸酶

植酸酶(Phytases)能將磷酸殘基從植酸上水解下來，破壞了植酸對礦物元素的親和力，增加礦物元素營養(yǎng)效價，釋放出的Ca2+可參與交聯(lián)反應(yīng)從而改變植物性食品質(zhì)地，因此在食品加工業(yè)領(lǐng)域具有重要開發(fā)和應(yīng)用價值。Ines等[43]對分離于突尼斯南部土壤的解淀粉芽胞桿菌US573植酸酶進行了純化。該酶是依賴Ca2+并對膽汁具有良好穩(wěn)定的酶(PHY US573)，最優(yōu)pH和溫度分別為7.5和70 ℃；在pH 4～10酶活穩(wěn)定，在100 ℃和90 ℃下加熱10 min，酶活性尚能保持50%和62%。該酶耐鹽性極強，在20 g/L NaCl和LiCl鹽濃度下，仍能保持80%和90%酶活力。該酶基因能編碼383 aa寡肽，與Bacillussp.MD2 和B.amyloliquefaciensDS11 (3 和5 aa殘基不同)熱穩(wěn)定性植酸酶一致率達99%，說明酶的熱穩(wěn)定性是由肽分子中同源性相似的氨基酸序列決定的。在含有鹽和肌醇六磷酸的土壤中使用該植酸酶能提高耐鹽性植物的磷利用效率。Xu等[44]為了增加植酸酶的活性，使用多重比和序列排布對不同來源微生物植酸酶結(jié)構(gòu)進行了分析，在此基礎(chǔ)上對解淀粉芽胞桿菌DSM 1061植酸酶表面(D148E、S197E 和N156E)和活性中心附近(D52E)的關(guān)鍵氨基酸殘基位點進行了選擇性定點突變。突變酶D148E和S197E在40～75 ℃范圍內(nèi)的比酶活分別比非突變酶增加35%和13%；kcat分別是野生酶的1.50和0.25倍。與野生酶相比，兩種突變酶的熱穩(wěn)定性明顯提高?？梢?，合理有效地利用解淀粉芽胞桿菌植酸酶的耐鹽、耐熱特點，將使植酸酶更好地應(yīng)用于食品加工行業(yè)。

4.3 解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的柚苷酶

柚苷酶(Naringinase)由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成，可以水解柚皮苷使果汁苦味減輕，是果汁脫苦的關(guān)鍵酶。柚苷酶具有將柚皮苷分解為普魯寧、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物質(zhì)的功能，并且這些物質(zhì)已廣泛用于制藥和飲料行業(yè)[45-46]。酈金龍等[47]利用前期篩選獲得的1株解淀粉芽胞桿菌11568進行液體發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶研究，考察不同碳源、氮源、pH值、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、金屬離子種類與濃度等對該菌株產(chǎn)柚苷酶能力的影響。通過單因素考察、響應(yīng)面分析可知，解淀粉芽胞桿菌11568液體發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最優(yōu)培養(yǎng)基成分(g/L):麥芽糖15.1,胰蛋白胨10，(NH4)2HP0420，NaC1 10，酵母提取物5；最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度40.9 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，pH 7.5，發(fā)酵時間48 h。在最優(yōu)條件下，柚苷酶活力達到201.12 U/mL，是優(yōu)化前的2.4倍。Zhu等[48]對土壤解淀粉芽胞桿菌11568胞內(nèi)柚苷酶進行了純化、鑒定，并描述了其特征。使用SDS-PAGE電泳分子獲得分子量為32 kDa的單一蛋白質(zhì)條帶。在45 ℃以下柚苷酶的最佳pH和溫度分別為7.5和45 ℃；在pH 3.5～8.5范圍內(nèi)，酶能保持穩(wěn)定；其Km和Vmax分別為 0.95 mmol/L和3 847.3 mmol/(L·min)。該酶能水解柚皮甙、新橙皮甙和其他苷類。檸檬汁中，當(dāng)酶濃度達到4 U/mL時，能有效地去除柚皮苷，減輕果汁苦味?？梢?，解淀粉芽胞桿菌的柚苷酶的研究也有很重要的價值，繼續(xù)開發(fā)解淀粉芽胞桿菌的柚苷酶，在藥品和飲料行業(yè)中必然會獲得更大的經(jīng)濟效益。

5 展 望

解淀粉芽胞桿菌是芽胞桿菌屬的一個種，在生長過程中產(chǎn)生了十分豐富的酶系，包括分解多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等的水解酶類，也包括其他重要酶類，如酯酶、溶栓酶、漆酶、植酸酶和柚苷酶等。該種桿菌對細(xì)菌、植物病原真菌甚至病毒均具有很強抗性，其中一些酶，例如幾丁質(zhì)酶、β-1，3葡聚糖酶本身就具有抗菌活性，其次級代謝產(chǎn)物的合成是與其特殊的基因組序列緊密相關(guān)，通過基因的表達，產(chǎn)生豐富的酶系。因此，解淀粉芽胞桿菌的優(yōu)勢與其產(chǎn)生的豐富代謝酶系直接相關(guān)。隨著全基因組測序數(shù)據(jù)的不斷積累和解析，其種類豐富的酶系基因功能將會被人們更多地認(rèn)識，這必將促進其在各領(lǐng)域的應(yīng)用，解淀粉芽胞桿菌高效、環(huán)保、無殘留的特點決定了其應(yīng)用空間的可塑性。隨著基因工程的發(fā)展，有針對性地構(gòu)建其優(yōu)良工程菌株，使用定點突變對菌株產(chǎn)酶特性加以優(yōu)化改造，利用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)有目的地研究各種酶催化機制，將使其應(yīng)用空間變得更加廣闊，最終帶來巨大的社會效益和生態(tài)效益。