嚴(yán) 濤， 朱建國(guó)， 姜 甜， 吳明科， 方曙光

(江蘇微康生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215200)

隨著人們對(duì)食品安全要求的提高，大量使用抗生素帶來的耐藥性、殘留等問題越來越引起關(guān)注，而益生菌制劑的無耐藥性和無殘留等優(yōu)點(diǎn)是未來發(fā)展的趨勢(shì)[1]。飼料中添加益生菌制劑能有效調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的菌群平衡，對(duì)畜禽的生長(zhǎng)性能、疾病的預(yù)防有明顯的改善作用[2]。優(yōu)良的益生菌制劑要具備高抗逆性，如耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫高壓等，而且還需具有抑制某些致病菌，儲(chǔ)存穩(wěn)定性好等特征。大部分益生菌(如乳酸桿菌)抗逆性較差，而凝結(jié)芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)具有以上抗逆性優(yōu)勢(shì)[3]，其所產(chǎn)生的芽胞能耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫高壓，已被美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)列入可用于飼料的安全微生物菌種名單[4]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2013年也將其列入可應(yīng)用于飼料添加劑的微生物菌種名單目錄。研究最多的領(lǐng)域?yàn)榧倚?豬)、家禽(雞)等方面[5]。凝結(jié)芽胞桿菌是同型產(chǎn)乳酸的芽胞桿菌[6]；兼性厭氧、桿狀，在30～50 ℃和pH值4～10范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)[7]，具有提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平的作用[8]。在生長(zhǎng)代謝中可產(chǎn)生多種酶類(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)[9]，可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。還能產(chǎn)生少量維生素、氨基酸、促生長(zhǎng)因子等，可為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)[10]。凝結(jié)芽胞桿菌產(chǎn)生的芽胞在飼料中比較穩(wěn)定，作為益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，所產(chǎn)乳酸能抑制其他病原微生物的數(shù)量，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，在飼料添加劑領(lǐng)域中應(yīng)用價(jià)值較高。本研究在飼糧中添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01，考察其對(duì)白羽肉雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)及腸道微生物的影響，為凝結(jié)芽胞桿菌BC01在白羽肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 凝結(jié)芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)BC01：有效活菌數(shù)1.0×1011cfu/g，由江蘇微康生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器及設(shè)備 雙人單面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(JY-SB-052，太倉(cāng)精密儀器設(shè)備有限公司)；迥旋式恒溫?fù)u床(HZQ-F160，太倉(cāng)精密儀器設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡(B203LED，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(YN75，上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在江蘇某大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)室進(jìn)行，選擇1日齡白羽肉雞300羽，預(yù)飼7 d。棄體重差異大的雞苗，剩余240羽肉雞正式開始試驗(yàn)，試驗(yàn)分為4組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組1喂基礎(chǔ)飼糧+凝結(jié)芽胞桿菌制劑(1×108cfu/kg)；試驗(yàn)組2喂基礎(chǔ)飼糧+凝結(jié)芽胞桿菌制劑(2×108cfu/kg)；試驗(yàn)組3喂基礎(chǔ)飼糧+凝結(jié)芽胞桿菌制劑(3×108cfu/kg)。基礎(chǔ)飼糧參照中國(guó)肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[11]并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)分為1～21日齡和22～42日齡兩個(gè)階段進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

注：1)預(yù)混料為每千克飼糧提供：1～21日齡：Ca 8.8 g，P 3.0 g，Cu 80 mg，F(xiàn)e 80 mg，Zn 80 mg，Mn 60 mg，I 0.4 mg，Se 0.14 mg，氯化膽堿600 mg，VA 15 000 IU，VE 80 IU，VD33 500 IU，VK 4 mg，VB14 mg，VB210 mg，煙酸45 mg，泛酸18 mg，蛋氨酸2.6 g，賴氨酸0.22 g；22～42日齡：Ca 8.0 g，P 2.8 g，Cu 80 mg，F(xiàn)e 80 mg，Zn 80 mg，Mn 60 mg，I 0.4 mg，Se 0.14 mg，氯化膽堿600 mg，VA 15 000 IU，VE 80 IU，VD33 500 IU，VK 4 mg，VB14 mg，VB210 mg，煙酸45 mg，泛酸18 mg，蛋氨酸2.3 g，賴氨酸0.2 g； 2)粗蛋白質(zhì)、鈣為實(shí)測(cè)值，其余均為計(jì)算值

1.2.2 飼養(yǎng)管理 雞舍采用中央空調(diào)控制溫度，第1～7天飼養(yǎng)溫度控制為34 ℃，第8～14天為30 ℃，之后為27 ℃；飼養(yǎng)的環(huán)境相對(duì)濕度第1～7天控制為70%，第8～14天為60%，之后55%左右；光照強(qiáng)度為30 lx。采用網(wǎng)上平養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食，每天清理雞糞1次，每天對(duì)飼料用量進(jìn)行記錄，每周對(duì)飼料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)1次，計(jì)算白羽肉雞的平均采食量。按照白羽肉雞飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行消毒、清掃，在飼養(yǎng)白羽肉雞的第21天、第42天，以重量為單位(g)進(jìn)行稱重，根據(jù)之前統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)計(jì)算日采食量、日增重量和料重比等相關(guān)的白羽肉雞性能指標(biāo)。

1.2.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定 在飼養(yǎng)白羽肉雞的第21天、第42天，白羽肉雞提前禁食12 h后，以重量為單位(g)進(jìn)行稱重，根據(jù)之前統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)計(jì)算日采食量、日增重量、料重比及死淘率等相關(guān)的白羽肉雞性能指標(biāo)。

1.2.4 免疫器官指數(shù)的測(cè)定 免疫器官包括胸腺、脾臟、法氏囊。飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行到第21天和第42天，白羽肉雞提前一天禁食后，每個(gè)重復(fù)組分別抽取試驗(yàn)白羽肉雞6只稱重，頸靜脈放血處死；獲取白羽肉雞的脾臟、胸腺、法氏囊等免疫相關(guān)器官并稱重，計(jì)算得出相應(yīng)的免疫器官指數(shù)(即免疫器官自身的重量與白羽肉雞的體重相除)。

1.2.5 腸道微生物數(shù)量的測(cè)定 在飼養(yǎng)的第21、42天，白羽肉雞提前禁食12 h后，每個(gè)重復(fù)組分別抽取試驗(yàn)白羽肉雞3只，處死后無菌操作分別稱取盲腸、回腸食糜各1 g，加入試管中裝有9 mL滅菌的生理鹽水中，充分搖勻后逐級(jí)10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的稀釋梯度平板，取1 mL稀釋菌液至滅菌平板上，傾注至麥康凱培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋濃度傾注3個(gè)重復(fù)平板。在37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[12]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

1～21日齡、22～42日齡試驗(yàn)組肉雞的死淘率隨結(jié)芽胞桿菌BC01的添加濃度的提高而逐漸降低，如表2所示，但試驗(yàn)組1與對(duì)照組不顯著(t=12.675 0，t=2.872 0，P>0.05)，而1～21日齡、22～42日齡的試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3均顯著低于對(duì)照組(t=5.581 0，t=4.163 0；t=5.236 0，t=7.366 0，P<0.05)；從生長(zhǎng)性能結(jié)果來看，其1～21日齡、22～42日齡的試驗(yàn)組2中的平均日增重、料重比顯著性的優(yōu)于對(duì)照組(t=-18.540 0，t=-9.543 1；t=2.209 1，t=2.908 1，P<0.05)，1～21日齡、22～42日齡的試驗(yàn)3中的平均日增重、料重比也顯著性的優(yōu)于對(duì)照組(t=-25.494 2，t=-11.117 1；t=3.368 2，t=2.823 4，P<0.05)，但1～21日齡、22～42日齡試驗(yàn)組1的平均日增重、料重比與對(duì)照組不顯著(t=-2.532 1，t=-2.800 1；t=1.091 0，t=1.072 0，P<0.05)。說明飼料中添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01的量足夠的前提下，可以提高白羽肉雞的采食量，降低料重比，提高飼料利用率。

表2 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)白羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

2.2 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

21日齡，試驗(yàn)組2的白羽肉雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)均顯著高于未添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01的對(duì)照組(t=-12.383 1，t=-15.967 2，t=-45.385 0，P<0.05)，如表3所示，試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)組1中的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)均高于對(duì)照組，但是試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3之間差異不顯著(P>0.05)。42日齡，試驗(yàn)組2肉雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)均高于對(duì)照組，但是不顯著(t=-11.418 1，t=-1.705 1，t=-3.469 1，P>0.05)，可能是白羽肉雞在生長(zhǎng)后期免疫器官增長(zhǎng)速度趕不上白羽肉雞的體重增長(zhǎng)速度，從而使器官指數(shù)差異顯著性降低。肉雞體內(nèi)免疫器官指數(shù)的提高，特別是脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)，說明白羽肉雞對(duì)外界的刺激反應(yīng)程度，間接表明白羽肉雞免疫力的提升。說明白羽肉雞飼料中添加一定量的凝結(jié)芽胞桿菌BC01，能刺激白羽肉雞的免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高白羽肉雞的免疫器官指數(shù)，進(jìn)而對(duì)白羽肉雞免疫力的提高有一定的積極影響。

表3 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)白羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)肉雞腸道微生物數(shù)量的影響

21、42日齡，試驗(yàn)組白羽肉雞飼料中由于添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01，菌體生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生乳酸，使腸道中pH值降低，抑制了大腸埃希菌的生長(zhǎng)，因此，21日齡的試驗(yàn)組2中盲腸、回腸中大腸埃希菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(t=11.306 1，t=9.752，P<0.05)，如表4所示。試驗(yàn)組42日齡試驗(yàn)組2白羽肉雞盲腸中的大腸埃希菌數(shù)量明顯低于對(duì)照組中的回腸(t=4.846 2，P<0.05)，而試驗(yàn)組1中大腸埃希菌在腸道中的數(shù)量雖然也在降低，但是其結(jié)果與對(duì)照組不顯著(t=8.455 2，P>0.05)，說明凝結(jié)芽胞桿菌BC01添加量的多少直接影響著腸道中大腸埃希菌的數(shù)量，但是數(shù)量要足夠。

表4 凝結(jié)芽胞桿菌BC01對(duì)肉雞腸道大腸埃希菌數(shù)量的影響(lg(cfu/g))

3 討 論

本研究在白羽肉雞飼料中添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01，其白羽肉雞的平均日增重均高于未添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01的對(duì)照組，而平均日采食量則與對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明白羽肉雞日糧中添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01，能提高其飼料轉(zhuǎn)化率[13]。凝結(jié)芽胞桿菌BC01代謝可能會(huì)產(chǎn)生相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、消化酶等，更有利于動(dòng)物的小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14]，改善動(dòng)物的消化功能[15]，從而提高動(dòng)物的飼料利用率[16]。

在禽類動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié)都需要胸腺、法氏囊和脾臟這三個(gè)免疫器官的參與，其免疫器官重量與自身體重的比值(即免疫器官指數(shù))大小可用來評(píng)價(jià)白羽肉雞的免疫力強(qiáng)弱[17]。本研究通過對(duì)白羽肉雞的21日齡、42日齡的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示其試驗(yàn)組的免疫器官指數(shù)均高于對(duì)照組。免疫器官相對(duì)重量的增加，說明畜禽機(jī)體的免疫功能也相應(yīng)增強(qiáng)[18]；免疫器官指數(shù)偏低，特別是雛雞，則不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，如果免疫器官指數(shù)較高，則畜禽分泌抗體的水平也相應(yīng)提升[19]。試驗(yàn)組1的白羽肉雞免疫器官指數(shù)雖然高于對(duì)照，但是不顯著，隨著凝結(jié)芽胞桿菌BC01添加劑量的增加，試驗(yàn)組2與試驗(yàn)組3顯著高于對(duì)照組，但試驗(yàn)組之間差異不顯著。說明添加一定數(shù)量的凝結(jié)芽胞桿菌才能顯著性地提升白羽肉雞的免疫力。但由于白羽肉雞在生長(zhǎng)發(fā)育后期其免疫器官增長(zhǎng)速度趕不上白羽肉雞的體重增長(zhǎng)速度，從而使白羽肉雞在后期器官指數(shù)整體有一定降低。凝結(jié)芽胞桿菌BC01能刺激并促進(jìn)白羽肉雞免疫器官的發(fā)育[20]，可能是凝結(jié)芽胞桿菌BC01在消化道上能識(shí)別抗原部位，可發(fā)揮免疫佐劑的功能，強(qiáng)化動(dòng)物體內(nèi)體液和細(xì)胞免疫水平提高，增加動(dòng)物整體免疫能力[21-23]。

在飼料中添加凝結(jié)芽胞桿菌，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能有效抑制或降低大腸埃希菌的數(shù)量，改善腸道微生態(tài)平衡[23]。本研究對(duì)21日齡和42日齡白羽肉雞的盲腸和回腸中的大腸埃希菌數(shù)量進(jìn)行活菌檢測(cè)。結(jié)果顯示試驗(yàn)組白羽肉雞的盲腸、回腸中大腸埃希菌數(shù)量均低于對(duì)照?？赡苁且?yàn)槟Y(jié)芽胞桿菌BC01為兼性厭氧菌，在肉雞腸道能快速地大量分裂增殖，消耗游離氧，使腸道呈厭氧狀態(tài)，同時(shí)能使一些碳水化合物通過其生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生同型乳酸[24]，降低pH值，這樣低pH值、厭氧的環(huán)境中能減少好氧微生物在腸道中的數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道中的菌群平衡，促進(jìn)有益厭氧微生物(雙歧桿菌、乳酸桿菌)的生長(zhǎng)，穩(wěn)定發(fā)揮其益生菌的益生功效，促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)[24]。

白羽肉雞日糧中添加凝結(jié)芽胞桿菌BC01，對(duì)白羽肉雞的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，可提高飼料轉(zhuǎn)化率，提升白羽肉雞的免疫力，提高白羽肉雞飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。綜合本研究結(jié)果，凝結(jié)芽胞桿菌BC01在白羽肉雞日糧中的最佳添加濃度為2×108cfu/kg。