劉姣姣， 劉菊梅， 張 笛， 木其爾， 袁 浩，趙 吉，2， 郭 永， 太田寬行， 包智華,2*

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；3.日本茨城大學(xué) 農(nóng)學(xué)部，茨城縣阿見町 300-0393)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 實(shí)驗(yàn)菌株Alsobactermetallidur-

ansSK200a-9和重金屬污染沉積物分離菌株Bacillussp. HK1均由日本茨城大學(xué)太田寬行教授提供，-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 ①PY培養(yǎng)基(g/L)用于菌株復(fù)壯：酵母提取物2.0，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 1.0；②AA合成培養(yǎng)基[15](g/L)：Tris(50 mmol/L) 6.05，Na2SO40.5，KH2PO40.2，MgCl2·6H2O 0.4，NaCl 1.2，NH4Cl 0.3，KCl 0.3，CaCl20.11，酵母提取物 (Difco) 1，CH3COONa 20，微量元素溶液A 10 mL，微量元素溶液B 10 mL，刃天青溶液(0.1%) 10 mL，其中微量元素溶液A、微量元素溶液B及刃天青溶液(0.1%)需單獨(dú)配制；③微量元素溶液A(g/L)：EDTA(2Na)·2H2O 1，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 0.2，H3BO30.05，CoCl2·6H2O 0.15，CuSO4·5H2O 0.15，NiCl2·6H2O 0.025，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1，Na2WO4·2H2O 0.05；④微量元素溶液B(g/L)：Na2SeO3·5H2O 0.05；⑤50 mmol/L的Tl儲備液：準(zhǔn)確稱取2.60 g TlNO3，溶解于超純水中，定容至200 mL；⑥ 256 mmol/L的KNO3儲備液：準(zhǔn)確稱取5.18 g KNO3，溶解于超純水中，定容至200 mL。

1.1.3 儀器與設(shè)備 高壓滅菌鍋(Auto clave-G136D，美國 ZEALWAY)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160，中國 HDL APPARATUS)，高速冷凍離心機(jī)(ROTINA 380R，德國 Labsun)，超微量紫外分光光度計(Nano Photometer P-class P360，德國 IMPLEN)，原子吸收光譜儀(iCETM3300 AAS，美國 Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 菌株生長曲線的測定 用無菌移液器吸取250 μL制備好的細(xì)胞懸液于10 mL含1 mmol/L Tl+的PY液體培養(yǎng)基中，以未添加Tl+的液體培養(yǎng)基作為空白對照，每組實(shí)驗(yàn)2個平行樣，所有樣品置于試管中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、160 r/min培養(yǎng)。在不同時刻取樣，用紫外分光光度計測定660 nm處的光密度，繪制菌株生長曲線。

1.2.2 菌株對重金屬鉈的吸附實(shí)驗(yàn) 吸取20 mL用AA培養(yǎng)基制備好的細(xì)胞懸液于500 mL含1 mmol/L Tl+的AA液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，每組實(shí)驗(yàn)2個平行樣。在對數(shù)生長期將培養(yǎng)液離心(4 000 r/min，15 min)，吸取5 mL上清液作為待測值，收集菌體。用5 mL 0.5 mmol/L EDTA洗脫菌體5次，每次洗脫之后4 000 r/min離心15 min，取上清液5 mL作為待測樣品。將所有待測樣品用0.22 μm濾膜過濾，原子吸收光譜儀測定樣品中的Tl含量。

1.2.3 添加Tl對細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量的影響 在K+濃度為AA培養(yǎng)基中的原始濃度0.04 mmol/L的條件下，將菌株SK200a-9和HK1分別接種于裝有500 mL AA培養(yǎng)基的錐形瓶中，設(shè)置Tl+最終濃度為0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L，選取未添加Tl+的培養(yǎng)液作為空白對照，每組實(shí)驗(yàn)2個平行樣，30 ℃、160 r/min恒溫培養(yǎng)。在對數(shù)生長期離心收集菌體，5 mL 0.5 mmol/L PIPES洗脫菌體5次后再次收集菌體。加入2 mL 60%濃硝酸，80 ℃消解3 h；冷卻后加入500 μL H2O2，90 ℃水浴1 h；最后用1%濃硝酸補(bǔ)足至5 mL。0.22 μm的濾膜過濾，測定溶液中Tl+和K+的濃度。收集菌體80 ℃烘干8 h，用于細(xì)胞內(nèi)離子濃度及生物量的計算。

1.2.4 添加K對細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量的影響 控制Tl+的濃度為1 mmol/L，調(diào)節(jié)K+的濃度為0、1、5、10 mmol/L，設(shè)置1組不加Tl+和K+的空白對照，每組實(shí)驗(yàn)2個平行樣，30 ℃、160 r/min恒溫培養(yǎng)。按照1.2.3方法考察添加K+對細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量的影響。

1.2.5 靜止細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 為測定細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+能否被K+逐出細(xì)胞外，在含有1 mmol/L Tl+培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，在靜止生長期取菌液5 mL作為待測樣品(0時刻)，向培養(yǎng)液中添加最終濃度為1 mmol/L的K+，待培養(yǎng)液靜置5、10、30 min時分別取5 mL菌液作為待測樣品。將所有待測樣品按照1.2.2方法洗脫細(xì)胞外吸附的鉈，測定細(xì)胞中的Tl+和K+濃度。

1.2.6 樣品中元素的測定 使用原子吸收光譜儀測定溶液中Tl+和K+的濃度。0.22 μm 濾膜過濾所有待測樣品，采用火焰原子吸收光譜法測定細(xì)胞中Tl+和K+的濃度。

1.2.7 細(xì)胞中離子濃度的計算公式c=ε×5÷η

式中：c為細(xì)胞中的離子濃度，ng/mg DW(DW指干重)；ε為待測樣品中的離子濃度，ng/mL；η為菌體干燥重量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在不同培養(yǎng)條件的生長曲線

從圖1可以看出菌株SK200a-9生長比較緩慢，在培養(yǎng)1 d后進(jìn)入對數(shù)生長期，72 h的菌體光密度已接近峰值，OD660為0.97，進(jìn)入穩(wěn)定期；與空白對照相比，菌株SK200a-9在1 mmol/L Tl+脅迫下的生長基本不受抑制，說明該菌株對Tl具有較強(qiáng)的耐性。而對照菌株HK1生長較快，在培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；在1 mmol/L Tl+脅迫下的生長也基本不受抑制，說明該菌株對Tl也具有較強(qiáng)的耐性。

圖1 菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of strains

2.2 菌株對Tl+的體外吸附

為了準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量，進(jìn)行了完全去除菌株SK200a-9和HK1細(xì)胞外吸附的Tl+的預(yù)實(shí)驗(yàn)。添加Tl+濃度為1 mmol/L，用0.5 mmol/L EDTA對細(xì)胞外吸附的Tl+進(jìn)行洗脫。根據(jù)表1可知，洗脫4次才能將細(xì)胞外吸附的Tl+全部去除。所以在后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累實(shí)驗(yàn)中，選擇洗脫次數(shù)為5次，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 洗脫次數(shù)與上清液中Tl+的質(zhì)量濃度

2.3 不同濃度Tl+對細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量的影響

由圖2可知，K+濃度為培養(yǎng)基內(nèi)的原始濃度時(0.04 mmol/L)，當(dāng)Tl+濃度<1 mmol/L時，與空白對照組相比，隨著培養(yǎng)基內(nèi)Tl+濃度的增加，SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+濃度增加的同時細(xì)胞內(nèi)K+濃度減少，這可能是由于Tl的離子半徑和K的離子半徑相似，從而使Tl+通過K+運(yùn)輸系統(tǒng)代替K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)Tl+濃度為1 mmol/L時，細(xì)胞內(nèi)Tl+濃度達(dá)到最大量255.5 ng/mg DW，細(xì)胞內(nèi)K+的濃度降到最低，為50.71%。而Tl+在對照菌株HK1細(xì)胞內(nèi)最大積累量僅為41 ng/mg DW。此結(jié)果表明SK200a-9細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+遠(yuǎn)高于HK1，且細(xì)胞內(nèi)的K+可能被Tl+代替。

2.4 K+添加對細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量的影響

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)的Tl+濃度為1 mmol/L時，隨著K+濃度的增加SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+濃度增加(圖3A)。當(dāng)K+濃度為5 mmol/L時，細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量達(dá)到最大值419.0 ng/mg DW，說明K+促進(jìn)了Tl+在細(xì)胞內(nèi)積累，可能是K+進(jìn)入細(xì)胞時Tl+也隨之進(jìn)入，這些結(jié)果暗示了Tl+使用K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的可能性；當(dāng)K+濃度>5 mmol/L時，隨著K+濃度的增加細(xì)胞內(nèi)Tl+的濃度開始降低，這可能是K+對Tl+在細(xì)胞內(nèi)的積累產(chǎn)生了競爭。而菌株HK1在添加K+濃度為1 mmol/L時，細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量達(dá)到最大值48 ng/mg DW，遠(yuǎn)低于SK200a-9細(xì)胞內(nèi)的積累量。同時，在只添加Tl+或同時添加Tl+和K+的培養(yǎng)基內(nèi)，菌株SK200a-9的最大生長量相對值基本沒有變化(圖3A)，這說明1 mmol/L Tl+并不會對菌株SK200a-9的生長產(chǎn)生抑制作用，菌株SK200a-9對重金屬鉈具有較強(qiáng)的耐性；菌株HK1的最大生長量稍有降低(圖3B)，說明其對鉈也具有較強(qiáng)的耐性。

2.5 靜止細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

由圖4可知，在添加K+之前向培養(yǎng)基中添加1 mmol/L Tl+，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，在對數(shù)生長期時菌體細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量為100%，隨后向培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的K+，在細(xì)胞的靜置時間為5～30 min內(nèi)，與對照菌株HK1相比(圖4B)，SK200a-9細(xì)胞內(nèi)的Tl+濃度由于K+的添加而隨時間明顯降低，細(xì)胞內(nèi)K+濃度由于K+的添加而明顯升高(圖4A)。結(jié)果表明由于K+的加入，SK200a-9細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+向外排出，同時細(xì)胞外的K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

圖2 Tl+的添加對菌株細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量及K+相對濃度的影響Fig.2 Effect of Tl+ addition on Tl+ accumulation and relative abundance of K+ in cells of strains

圖3 K+添加對菌株細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量及生長量的影響Fig.3 Effect of K+ addition on Tl+ accumulation in cells and relative biomass of strains

圖4 菌株靜止細(xì)胞在不同時刻細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量Fig.4 The accumulation of Tl+ in static cells of strains at different time

3 討 論

不同的微生物對鉈的敏感程度、耐性機(jī)制有所差異。Norris等[19]進(jìn)行了鉈對微生物毒性的研究，耐性較低的巨大芽胞桿菌KM(MIC，0.015 mmol/L)、大腸埃希菌 (0.9 mmol/L) 和釀酒酵母 (0.75 mmol/L) 的鉈毒性研究顯示，巨大芽胞桿菌KM比釀酒酵母和大腸埃希菌對重金屬Tl更敏感。本研究中使用的供試菌株SK200a-9(MIC，4.4 mmol/L)和HK1(MIC，3.9 mmol/L)鉈耐性較強(qiáng)(Bao et al.，2006)，在1 mmol/L Tl+脅迫條件下生長不受抑制。但是SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+的最大積累量(255.5 ng/mg DW)遠(yuǎn)大于對照菌株HK1的積累量(41 ng/mg DW)，說明SK200a-9菌體內(nèi)的Tl+容許度大于HK1。這種差異可能是由于兩株菌對Tl+的耐性機(jī)理不同造成的。培養(yǎng)基中1 mmol/L Tl+存在時SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+基本達(dá)到飽和，但并沒有產(chǎn)生毒性，原因可能有以下幾個方面：①通過細(xì)胞表面吸附抑制其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；②進(jìn)入細(xì)胞后又排到細(xì)胞外降低對細(xì)胞的毒害作用；③進(jìn)入細(xì)胞后與某些蛋白質(zhì)結(jié)合失去其毒性；④轉(zhuǎn)換成毒性較低的價態(tài)降低對細(xì)胞的毒害。

本研究中，培養(yǎng)基中K+和Tl+的濃度對菌株SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累量有很大影響，但對HK1基本沒有影響。這與靜止細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較類似：SK200a-9細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+被K+置換比較明顯，而HK1不明顯。添加K+明顯促進(jìn)了SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累，但對HK1的促進(jìn)作用要小得多。這可能是由于兩種生物體對K+和Tl+攝取的相對親和力不同，Tl+作用的位點(diǎn)不同。Tl+和K+的比值增加到1∶5時細(xì)胞內(nèi)Tl+濃度也最高(419 ng/mg DW)，但對相對生物量幾乎沒有影響，說明K+的添加促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累，而且Tl+優(yōu)于K+保留在細(xì)胞中。已知研究表明Tl+在細(xì)胞內(nèi)的積累與K+的運(yùn)輸系統(tǒng)有關(guān)[19]，隨培養(yǎng)基中Tl+濃度增加，其在細(xì)胞內(nèi)積累量增加，K+濃度減少，這與本研究結(jié)果一致。而 Damper等[20]的研究表明大腸埃希菌對Tl+的積累主要通過Kdp(一種K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))或者Trk進(jìn)行，而且細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+也被K+置換出細(xì)胞外。K+添加的SK200a-9靜止細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也暗示了Tl+在SK200a-9細(xì)胞內(nèi)的積累是通過K+運(yùn)輸系統(tǒng)的可能性。

綜上所述，鉈耐性菌株SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+積累量遠(yuǎn)大于菌株HK1。K+濃度為培養(yǎng)基中的原始濃度(0.04 mmol/L)時，由于Tl+的添加SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+濃度增加，K+的濃度下降，表明SK200a-9細(xì)胞內(nèi)的K+可能被Tl+代替，但無毒害作用；Tl+濃度為1 mmol/L時SK200a-9細(xì)胞內(nèi)積累量達(dá)到255.5 ng/mg DW。K+的添加促進(jìn)SK200a-9細(xì)胞內(nèi)Tl+的積累。SK200a-9細(xì)胞內(nèi)積累的Tl+，由于K+的加入而降低。根據(jù)以上結(jié)果初步判斷，SK200a-9的鉈耐性機(jī)理可能是Tl+代替K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)積累，而K+也能使其排到細(xì)胞外。本研究中Tl+在細(xì)胞內(nèi)積累過程中膜蛋白的變化等有待進(jìn)一步研究。