吳振超， 高永生， 王 森， 王秋舉， 雷新雨， 張東鳴3，*， 陳玉珂*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118；3.通化師范學院，吉林 通化 134000)

隨著“無抗”養(yǎng)殖的大力發(fā)展，抗生素的替代研究越來越受到研究者的重視。其中，益生菌作為抗生素的替代品在養(yǎng)殖領(lǐng)域取得了矚目的成就，且具有廣闊的發(fā)展前景[1]。益生菌，也稱益生素，是一類具有調(diào)節(jié)宿主腸道與腸道菌群之間生態(tài)平衡作用的活性微生物[2]。大量的國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，益生菌具有抑制有害菌的生長和強化宿主腸道黏膜屏障等作用[3]。動物體內(nèi)有益的細菌或真菌主要有：酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、放線菌(Actinomycesbovis)、酵母菌(Yeast)等幾大類。而在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的益生菌主要有：芽胞桿菌(Bacillus)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、酵母菌等，它們主要來自畜禽的腸道或其生長環(huán)境中[4]。研究者發(fā)現(xiàn)益生菌在宿主腸道的黏附作用具有特異性，因此非同源的益生菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用效果并不理想[5]。目前，益生菌的應(yīng)用面臨的主要問題是可應(yīng)用的菌種少和菌種黏附性差。所以篩選黏附性高的菌種是益生菌開發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵。研究表明，益生菌進入動物的腸道后會逐漸形成穩(wěn)定的菌群，進而發(fā)揮營養(yǎng)、免疫和代謝等作用[6]。益生菌只有在宿主腸道中穩(wěn)定定殖，才可以進行菌群繁殖，進而發(fā)揮自身的益生功效。而益生菌的黏附能力是其在宿主腸道中定殖的關(guān)鍵因素，也是益生菌質(zhì)量檢測和篩選的重要標準。因此，益生菌黏附能力評估模型的建立是益生菌開發(fā)過程中最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。目前，常用的益生菌黏附能力評估模型都具有一定的局限性，并不能夠準確地反映益生菌在宿主腸道中真實的黏附狀態(tài)，對于腸道益生菌黏附能力的檢測尚未建立精確、經(jīng)濟高效、省時省力的理想模型。因此通過進一步對益生菌在腸道中黏附機制的研究，結(jié)合宿主腸道內(nèi)的真實環(huán)境，構(gòu)建穩(wěn)定高效的益生菌黏附能力評估模型是解決養(yǎng)殖業(yè)中益生菌菌種少和黏附能力差等問題的關(guān)鍵。

1 益生菌黏附能力的評估模型

近幾年來，在微生物領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的黏附能力評估模型有體外細胞黏附模型、體外黏液黏附模型、體外腸組織模型和體內(nèi)黏附模型。但由于體外模型與真實的腸道環(huán)境相差較大，很難準確地評價菌株的黏附能力，通常需要與體內(nèi)黏附模型相結(jié)合來進行試驗檢測。目前，有大量的國內(nèi)外學者通過對益生菌在宿主腸道中的黏附機制進行研究，建立了多種益生菌黏附能力評估模型，以下是近幾年益生菌黏附能力評估模型的研究進展。

1.1 體外細胞黏附模型

體外細胞黏附模型是通過體外培養(yǎng)腸上皮細胞來檢測益生菌菌株黏附能力的方法，也是使用最廣泛的一種黏附能力檢測手段。目前主要有以CaCo-2、HT-29、IEC和IPEC-J2等細胞系建立的模型。大量的研究證實，體外細胞模型能夠簡單、快速、直觀有效地檢測益生菌的黏附能力[7-11]。Gopal等[12]通過CaCo-2、HT-29以及HT29-MTX的細胞模型檢測了雙歧桿菌和乳桿菌的黏附能力。Gagnon等[13]通過CaCo-2細胞黏附模型從人糞便中分離出黏附性強的雙歧桿菌。Larsen等[14]通過運用IPEC-J2細胞系研究了鈣離子對乳酸桿菌的黏附狀態(tài)及對大腸埃希菌(Escherichiacoli)抑制的影響。Huang等[15]利用C2BBe1細胞株建立了乳酸菌益生菌腸道黏附的體外模型，并就嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的黏附性與CaCo-2細胞模型進行了對比，證明C2BBe1可作為CaCo-2的替代物來評價益生菌菌株的體外黏附特性。

體外細胞黏附模型雖然具有直觀有效的特點，但在應(yīng)用過程中，此模型卻忽略了細菌在宿主腸道內(nèi)黏附時的真實環(huán)境。宿主腸道的上皮細胞表面還覆蓋一層黏液保護層，黏液層主要由糖脂、高度糖基化的大分子蛋白或黏蛋白組成，是細菌黏附定殖的主要位置[16]。腸道上皮細胞會持續(xù)更新，黏液不斷分泌，所以在細菌與腸上皮細胞未接觸之前，已經(jīng)被退化的黏液和腸道內(nèi)容物從黏液表面清除掉，因此通過體外細胞模型僅僅可以判斷大部分益生菌暫時的黏附能力。Schijrin等[17]發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌(Bifidobacterium.Lactis)對腸細胞系CaCo-2黏附較差，而Kirjavainen等[18]試驗證明，乳雙歧桿菌對腸黏液黏附能力較高，這說明在腸黏液上具有高黏附性的菌株，并不能與腸道上皮細胞達到良好的黏附效果。所以組織培養(yǎng)腸上皮細胞并不能真實有效地檢驗益生菌的黏附性，需要建立一種更準確的新型模型為益生菌黏附性試驗提供方法。

1.2 體外黏液(黏液蛋白)黏附模型

由于體外黏液黏附模型中所應(yīng)用的黏液蛋白多數(shù)直接來自宿主的腸道內(nèi)，因此通過體外的黏附試驗，根據(jù)菌株在宿主體內(nèi)的定殖情況，可以直接判斷宿主腸道中益生菌黏附受體是否存在。但是由于動物腸道中有多種細菌存在，而不同細菌之間存在空間位點和營養(yǎng)競爭的情況。即使在同一種微生態(tài)環(huán)境中，也存在兩種或兩種以上的微生物對同一黏附位點或者腸上皮細胞及其生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)進行競爭的情況[29-31]。所以黏液蛋白的應(yīng)用只是考慮了黏液蛋白的來源，而忽略了益生菌在宿主體內(nèi)定殖時的真實環(huán)境，具有一定的局限性[32]。

1.3 體外腸組織模型

體外腸組織模型是通過動物腸組織分離進行體外培養(yǎng)而建立的模型，它更接近于動物體內(nèi)的真實環(huán)境，因此，在實際應(yīng)用中常結(jié)合免疫組化和熒光標記等技術(shù)來檢測益生菌在腸組織中的定殖情況，也更能準確地檢測到在腸道組織的影響下益生菌的黏附作用。Saremdamerdji 等[33]通過對離體的腸組織進行體外培養(yǎng)，采用活菌計數(shù)法檢測了益生菌與腸黏膜之間的黏附性能。王斌[34]結(jié)合免疫組化技術(shù)在小鼠體外腸組織模型中檢測了羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的黏附性，并成功篩選到高黏附性的乳桿菌。Vesterlund 等[35]運用腸組織模型采用熒光標記技術(shù)研究了鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusbrhamnosus)GG株的黏附能力以及其對傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的黏附抑制特征。雖然體外腸組織模型能夠更好地模擬體內(nèi)真實環(huán)境，但也存在很多缺點。例如，培養(yǎng)的條件較為復雜，組織在體外的存活時間較短，實驗過程中成本較高，且熒光染料可能在與益生菌接觸過程中改變菌體的表面結(jié)構(gòu)，對其黏附性產(chǎn)生一定的影響等[36-38]。

1.4 黏附抑制模型

黏附抑制模型一般分為拮抗抑制、置換抑制和競爭抑制三種形式。黏附抑制模型用來評定益生菌對致病菌的黏附抑制強弱，并且可以由此建立防止感染的新方法[39]。劉文玉[40]通過拮抗抑菌實驗，篩選出兩株具有高黏附性的乳桿菌。黃燕華等[41]通過黏附抑制模型研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加乳酸菌對奧尼羅非魚的免疫和抗氧化能力具有提高作用。黏附抑制的檢測方法簡單易行，在實驗研究中應(yīng)用較廣，但由于該實驗方法靈敏度相對較低，工作量較大，實驗結(jié)果只能部分反映菌株的黏附能力，所以并不是最理想的模型，不適用于大規(guī)模的檢測。

1.5 體內(nèi)黏附模型

隨著實驗技術(shù)和儀器設(shè)備的發(fā)展，應(yīng)用高通量測序、熒光原位雜交(FISH)和脈沖場電泳(PFGE)等技術(shù)已經(jīng)能夠精確地檢測到微生物在宿主腸道的定殖情況。張棋等[42]通過點種法和牛津杯法，從中華鱉腸道中篩選到 1 株對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)以及豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)等具有拮抗作用的菌株。Zhou 等[43]通過 rpo B-PCR 變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，研究了黏附在斑馬魚(Barchydanioreriovar)腸道中的乳酸桿菌的多樣性，通過嗜水氣單胞菌侵染實驗驗證了黏附菌株定殖力的強弱。體內(nèi)黏附模型多數(shù)是通過飼養(yǎng)試驗后，再采用高通量測序、熒光原位雜交和脈沖場電泳等技術(shù)檢測益生菌在宿主腸道的黏附效果[44]。它是目前運用最普遍，也是最準確的一種黏附力評估模型。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，一些新的黏附模型也正在被逐步研究發(fā)掘。Schultz等[45]通過將攜帶改造過的GFP基因高拷貝數(shù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入1株治療潰瘍性結(jié)腸炎的大腸埃希菌Nissle1917，建立了一種新型的轉(zhuǎn)基因黏附模型，但由于GFP在體內(nèi)的表達并不穩(wěn)定，這一模型仍在研發(fā)階段。Rodes等[46]采用細菌包覆的顆粒，模擬腸道內(nèi)壁和其他特征建立了一種連續(xù)流式生物反應(yīng)器，成為檢測益生菌黏附力的新模型。由于該模型能夠模擬宿主腸道環(huán)境，因此具有潛在的應(yīng)用價值。

2 細菌黏附能力的檢測方法

2.1 直接計數(shù)法

細菌黏附試驗完成后，收集黏附在細胞上或黏液上的細菌，經(jīng)梯度稀釋后涂布平板培養(yǎng)并菌落計數(shù)，根據(jù)試驗結(jié)果進行黏附效果的評價。這種方法操作比較簡單，并且不需要特殊設(shè)備，在一般實驗室就能進行操作，但是工作量非常大。

2.2 分光光度計法

分光光度法是通過使用染料對黏附在細胞上或黏液上的細菌進行染色，記錄細菌黏附前后的吸光值變化，對黏附的細菌進行計數(shù)。這種方法操作簡便，對試驗設(shè)備要求較低，但要求待測的菌株黏附能力較強，且細菌的數(shù)量要足夠多，否則可能達不到分光光度計的檢測靈敏度要求。目前，研究者們經(jīng)常應(yīng)用分光光度法測定微生物黏著碳氫化合物法測定疏水性和細菌的自凝聚能力，對細菌黏附性進行預測和初步篩選[47]，作為菌株篩選非常有效的輔助手段。張明輝等[48]以HT-29 細胞為體外黏附篩選模型，采用分光光度計法分析了植物乳酸菌菌株黏附能力與表面疏水性、自聚共聚能力等表型特征的相關(guān)性，進而建立植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)黏附力與表面特征關(guān)系的模型，為篩選高黏附性植物乳酸菌提供了參考。

2.3 放射性同位素法

這種方法具有試驗結(jié)果更為準確、檢測靈敏度高及試驗的重復性好等優(yōu)點。目前常用的放射性同位素有H3、51Cr和I125，最常用的是H3標記的胸腺嘧啶核(TdR)。細菌對黏液蛋白的黏附率是通過測定用放射性物質(zhì)標記的細菌在與固定化黏液蛋白黏附前后的放射量之比[49]，也有研究者使用細菌與固定化黏液蛋白黏附固定后的放射量，與該菌在牛血清白蛋白(BSA)模型黏附后放射量之比來表示[50]。放射性同位素標記法一般試驗成本較高，同時也存在較大的安全隱患。

2.4 熒光標記法

熒光標記法類似于放射性同位素法。主要是將標志物與底物溫育后沖洗，采用戊二醛固定處理，然后直接通過流式細胞儀或熒光顯微鏡觀察底物黏附的細菌數(shù)目[51]。該方法常用異硫氰酸熒光素(FITC)作為標志物。根據(jù)一些細菌的特性，也可以選擇其他熒光物質(zhì)進行標記，有研究者用細胞增殖示蹤熒光探針(CFDA-SE)標記細菌，通過測定細菌與細胞黏附前后熒光物質(zhì)的發(fā)光強度，評價細菌對細胞的黏附能力[52]。也有研究者在熒光檢測之前將包含編碼熒光蛋白的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到乳酸菌內(nèi)，以熒光強度評定細菌的黏附力[53]。熒光標記法操作復雜，對試驗設(shè)備要求較高，并且隨著時間的延長，熒光物質(zhì)的熒光性會慢慢減弱，同時，熒光標記能夠改變細菌的表面特性或影響細菌的存活能力，從而影響實驗結(jié)果的可靠性，因此該方法在實際應(yīng)用中較少。

2.5 細菌特異性抗體

應(yīng)用此方法的前提是先制備細菌或表面物質(zhì)的單克隆抗體，用該抗體與細胞做ELISA或蛋白印跡試驗，獲得目標黏附素。該方法能準確地尋找到菌株在宿主的黏附位點，有利于進一步深入挖掘菌株與宿主的黏附機制。但是在試驗過程中極易出現(xiàn)交叉反應(yīng)[54]，誤導試驗結(jié)果。當處理樣品較少時，由于前期制備抗體的工作量較大，并不適合用此方法。但是如果有特異性好的抗體時，采用ELISA 法能更好地檢測細菌的黏附性，該技術(shù)操作簡便，可同時處理大量樣本[55]。受抗體的影響，該方法的發(fā)展受到了極大地限制。

隨著近幾年基因組學和分子生物學的迅速發(fā)展，高通量測序、熒光原位雜交和脈沖場電泳等技術(shù)已經(jīng)能夠精確地檢測到微生物在宿主腸道的定殖情況，極大地提高了檢測益生菌在活體腸道內(nèi)黏附能力的準確性。例如，前文提到的Schultz等文獻采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的新模型就能夠簡單準確地檢測細菌的黏附狀況。因此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，細菌黏附性的檢測技術(shù)會取得更大的進步，也會產(chǎn)生更多更高效的益生菌黏附模型。

3 展 望

在健康養(yǎng)殖的大背景下，養(yǎng)殖業(yè)對高黏附性益生菌的需求愈發(fā)強烈，因此建立一個合適的益生菌黏附力評估模型尤為重要。然而，從目前的研究手段來看，僅應(yīng)用一種黏附模型來評估菌株的黏附力并不能真實反映菌株對宿主腸道的黏附效果。應(yīng)該同時采用體內(nèi)體外多種模型，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，綜合分析菌株在多種模型中的黏附效果，才能相對準確地獲得菌株在宿主腸道中的黏附特性。