袁建民，何 璐*，楊曉瓊，許智萍，孔維喜

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；2.云南元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300)

0 引言

香葉天竺葵(PelargoniumgravelensL.)別名摸摸香、驅(qū)蚊草等，為牻牛兒苗科天竺葵屬雙子葉多年生亞灌木植物，原產(chǎn)于非洲南部，現(xiàn)主產(chǎn)于法國(guó)、埃及、摩洛哥和中國(guó)等地，在我國(guó)主要分布于云南、四川、江蘇、浙江、福建和廣東等地，其中云南仍為主要種植區(qū)域，并以云南省賓川縣種植面積最大。香葉天竺葵全株可入藥，味辛性溫，具有治療風(fēng)濕、疝氣陰囊濕疹、抗癌、抗腫瘤等功效[1]。其提取的精油稱(chēng)為香葉油，富含香葉醇、玫瑰醇、香茅醇等化學(xué)成分，可用于調(diào)制香水、香精，還可用作食品、藥品和化妝品的添加劑，現(xiàn)已成為全球香料產(chǎn)業(yè)的重要原料，香葉天竺葵開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。

現(xiàn)有關(guān)于香葉天竺葵的研究主要集中于組培快繁[2-7]、栽培技術(shù)[8-11]、化學(xué)成分[12-15]、藥理作用[16-20]、香料香精[21-22]等方面，而對(duì)無(wú)機(jī)元素含量及分布規(guī)律的研究卻鮮有報(bào)道。無(wú)機(jī)元素參與生物體中酶、激素和維生素等的生理活性反應(yīng)，對(duì)有機(jī)體的正常代謝具有重要作用。前人研究表明，無(wú)機(jī)元素含量可以表征不同產(chǎn)區(qū)植物樣品品質(zhì)的差異性[23]、無(wú)機(jī)元素可用于鑒定栽培與野生資源[24]、無(wú)機(jī)元素含量與活性成分之間存在密切相關(guān)性[25]、無(wú)機(jī)元素還可對(duì)藥材來(lái)源地進(jìn)行鑒別和歸屬[26]。另有研究表明，無(wú)機(jī)元素含量與藥材類(lèi)植物的藥性、藥效及重要成分如總黃酮、咖啡酸、多酚化合物等含量呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)[27-28]，同時(shí)重金屬限量也越來(lái)越受到關(guān)注。此外，一些無(wú)機(jī)元素與人體代謝、生理異?；蚣膊∶芮邢嚓P(guān)[29]，如B元素具有增加骨密度的作用，許多癌癥患者與缺Mo元素有關(guān)。因此，對(duì)香葉天竺葵中無(wú)機(jī)元素含量及分布規(guī)律的研究，對(duì)研究其物質(zhì)基礎(chǔ)及資源利用具有重要意義。

本研究利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測(cè)定干熱河谷條件下香葉天竺葵不同部位(老枝、嫩枝、葉片)中19種無(wú)機(jī)元素的含量，采用單因素方差分析、聚類(lèi)分析、相關(guān)性分析、因子分析等統(tǒng)計(jì)方法分析其分布規(guī)律，以期對(duì)香葉天竺葵不同部位中無(wú)機(jī)元素含量和分布有更深入了解，為香葉天竺葵的有效開(kāi)發(fā)和綜合加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

田間試驗(yàn)于2018年3～10月在云南省元謀縣云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所香葉天竺葵試驗(yàn)基地進(jìn)行。室內(nèi)試驗(yàn)于2018年7～9月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所干熱河谷生態(tài)農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。香葉天竺葵試驗(yàn)基地位于金沙江干熱河谷元謀段( 25°23′～26°06′ N，101°35′～102°06′ E)，海拔1100 m，此區(qū)域內(nèi)氣候以干熱為典型特征，年平均氣溫21.9 ℃，極端最高氣溫42 ℃，極端最低氣溫-2 ℃，年降水量613.8 mm，主要集中在5～9月，其他月份少雨或無(wú)雨，年蒸發(fā)量3911.2 mm。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為來(lái)源于云南賓川縣的香葉天竺葵種質(zhì)資源(編號(hào)為Z3)的葉片、嫩枝、老枝。2018年3月種植于云南省元謀縣云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所香葉天竺葵試驗(yàn)基地。生長(zhǎng)年限為1年生，株行距為0.5 m×0.5 m。2018年7月采集其成熟葉片、嫩枝(成熟度達(dá)50%，木質(zhì)化程度低，顏色為綠色)和老枝(成熟度達(dá)100%，木質(zhì)化程度高。顏色為褐色)，3次重復(fù)(每5株植株為1重復(fù))。鮮樣經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈，剪成小段，裝入信封紙袋，于65～70 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘至恒重，經(jīng)研磨機(jī)粉碎，過(guò)尼龍篩，混勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器與試劑

PQ9000電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)，由德國(guó)耶拿生產(chǎn)；微波消解儀Milestone Ethos up(maxi-44)，由意大利邁爾斯通生產(chǎn)；超純水儀UPH-IV-20T，由中國(guó)優(yōu)普生產(chǎn)；萬(wàn)分之一分析天平(ATX224，由日本島津公司生產(chǎn))；研磨機(jī)(FSJ-A03D1，Bear)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9140MBE，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))；移液槍(RAININ，由美國(guó)瑞寧生產(chǎn))；濃硝酸(優(yōu)級(jí)純，由重慶川東化工有限公司生產(chǎn))；30%過(guò)氧化氫(優(yōu)級(jí)純，由天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)生產(chǎn))；超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、TI、V、Zn共24種元素)，以及K、Ca、Na、P、S、Se、Si、Mo等單個(gè)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。氬氣純度≥99.999%。試驗(yàn)用水均為超純水；容量瓶、燒杯等玻璃器皿均用10%硝酸浸泡24 h，均用超純水清洗烘干備用。

1.4 試驗(yàn)方法

每份樣品分別稱(chēng)取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)0.2000 g，采用6 mL濃硝酸和2 mL雙氧水的混合酸浸泡過(guò)夜，利用微波消解儀進(jìn)行樣品消解，同時(shí)做空白試驗(yàn)，利用ICP-OES測(cè)定B、Zn、Fe、Mg、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu、Co、Ca、K、Mo、Na、P、S、Se、Si共19種元素含量。微波消解程序：消解功率為1800 W，第一步：溫度為140 ℃，保持時(shí)間5 min，爬升時(shí)間15 min；第二步：升溫至180 ℃，保持時(shí)間20 min，爬升時(shí)間10 min；第三步：冷卻至室溫，冷卻時(shí)間20 min。ICP-OES工作參數(shù)：等離子體觀測(cè)方式為軸向(axial)；高頻發(fā)射器功率為1200 W；氬氣壓力為0.65 MPa；冷卻氣流量12 L/min；輔助氣流量0.5 L/min；霧化氣流量0.5 L/min；蠕動(dòng)泵正常流速1.00 mL/min；正常進(jìn)樣時(shí)間15 s；快泵流速4.0 mL/min；清洗時(shí)間5 s；積分時(shí)間1 s；測(cè)量次數(shù)3次。B、Zn、Fe、Mg、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu、Co、Ca、K、Mo、Na、P、S、Se、Si共19種元素檢測(cè)波長(zhǎng)分別為B 249.773 nm、Zn 206.200 nm、Fe 259.940 nm、Mg 279.553 nm、Mn 257.610 nm、Ni 231.604 nm、Pb 220.353 nm、Cr 267.716 nm、Cd 214.441 nm、Cu 324.754 nm、Co 228.615 nm、Ca 317.933 nm、K 766.491 nm、Mo 202.030 nm、Na 589.592 nm、P 213.618 nm、S 180.672 nm、Se1 96.028 nm、Si 251.611 nm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2003軟件進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析、相關(guān)性分析、聚類(lèi)分析和因子分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香葉天竺葵不同部位無(wú)機(jī)元素含量分析

香葉天竺葵不同部位中19種無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，供試香葉天竺葵葉片、嫩枝、老枝中均檢出B、Zn、Fe、Mg、Mn、Ni、Cr、Ca、K、Na、P、S共12種元素；Pb、Cd、Co、Mo、Se、Si元素均未檢出，而Cu元素僅在葉片中檢出。香葉天竺葵葉片無(wú)機(jī)元素含量呈現(xiàn)Ca>K>P>S>Na>Mg>Fe>Cr>Mn>Zn>B>Cu>Ni的趨勢(shì)；嫩枝中無(wú)機(jī)元素含量呈現(xiàn)K>Ca>P>S>Na>Mg>Fe>Cr>Mn>Zn>B>Ni的趨勢(shì)；老枝中無(wú)機(jī)元素含量呈現(xiàn)K>Ca>P>S>Na>Mg>Cr>Fe>Mn>Zn>B>Ni的趨勢(shì)。

表1 香葉天竺葵不同部位19種無(wú)機(jī)元素的含量mg/kg干重

注：表中數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；ND表示未檢出；同行小寫(xiě)字母表示各元素在不同部位之間的差異顯著性，字母相同，則差異不顯著(P>0.05)，不同則顯著(P<0.05)。

2.2 單因素方差分析

香葉天竺葵不同部位19種無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果顯示，由于Pb、Cd、Co、Mo、Se、Si元素均未檢出，而Cu元素僅在葉片中檢出，故只選取剩余的12種元素作變量進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。以香葉天竺葵不同部位為變量，12種無(wú)機(jī)元素含量為因變量，對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析(表2)。結(jié)果顯示，香葉天竺葵不同部位中Mn、Cr元素含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，香葉天竺葵不同部位中B、Zn、Fe、Mg、Ni、Ca、K、Na、P、S元素含量存在顯著性差異(P<0.05)。進(jìn)一步研究結(jié)果表明(表1)，香葉天竺葵不同部位中B、Zn、Fe、Mg、Ni、Ca、K、Na、P、S元素含量高低順序存在一定差異。B、Zn、Fe、Ca元素含量高低順序?yàn)槿~片>嫩枝>老枝，Ni元素為葉片>老枝>嫩枝，Mg、Na、S元素為老枝>嫩枝>葉片，K、P元素為嫩枝>老枝>葉片。

2.3 相關(guān)性分析

以香葉天竺葵不同部位為變量，12種無(wú)機(jī)元素含量為因變量，對(duì)其進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析(表3)。結(jié)果表明：香葉天竺葵不同部位12種無(wú)機(jī)元素含量之間存在顯著或極顯著相關(guān)性。其中，B元素與Zn、Fe、Ni、Ca元素存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.824、0.972、0.708、0.807，B元素與Mg、K、Na、P、S元素存在極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.897、-0.893、-0.861、-0.745、-0.841；Zn元素與Fe、Ni、Ca元素存在極顯著正相關(guān)，Zn元素與Mg、K、Na、P、S元素存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；Fe元素與Ni、Ca元素存在極顯著正相關(guān)，F(xiàn)e元素與Mg、K、Na、P、S元素存在極顯著負(fù)相關(guān)；Mg元素與K、Na、P、S元素存在顯著或極顯著正相關(guān)，Mg元素與Ni、Ca元素存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；Mn元素與Ca元素存在顯著正相關(guān)；Ni元素與K、Na、S元素存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；Ca元素與K、Na、P、S元素存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；K元素與Na、P、S元素存在極顯著正相關(guān)；Na元素與P、S元素存在極顯著正相關(guān)；P元素與S元素存在極顯著正相關(guān)；其他元素之間相關(guān)性不顯著。

Pearson相關(guān)性只能說(shuō)明表面關(guān)系，而多種無(wú)機(jī)元素之間的內(nèi)在綜合關(guān)系需要借助多元統(tǒng)計(jì)分析方法。

表2 12種元素單因素方差分析結(jié)果

表3 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

注：*、**分別表示相關(guān)性達(dá)到0.05、0.01水平。

2.4 聚類(lèi)分析

以香葉天竺葵不同部位為變量，12種無(wú)機(jī)元素含量為因變量，采用系統(tǒng)聚類(lèi)法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。由圖1可知，12種無(wú)機(jī)元素將香葉天竺葵不同部位分為兩類(lèi)，葉片單獨(dú)聚為第一類(lèi)，嫩枝和老枝聚為第二類(lèi)，暗示香葉天竺葵的嫩枝和老枝12種無(wú)機(jī)元素的含量、存在狀態(tài)或者代謝模式類(lèi)似，而葉片中12種無(wú)機(jī)元素的含量、存在狀態(tài)或者代謝模式與嫩枝、老枝之間存在顯著差異。

2.5 因子分析

因子分析是實(shí)現(xiàn)降維的一種統(tǒng)計(jì)分析方法，用少數(shù)幾個(gè)變量盡可能多地解釋較多的原來(lái)變量信息，保證原信息損失較小且變量數(shù)目盡可能少。

以香葉天竺葵不同部位為變量，12種無(wú)機(jī)元素含量為因變量，提取公因子方法采用主成分法，旋轉(zhuǎn)法采用最常用的正交方差最大旋轉(zhuǎn)法，對(duì)香葉天竺葵不同部位無(wú)機(jī)元素進(jìn)行因子分析(表4)。通常以累積方差貢獻(xiàn)率不低于85%來(lái)確定公因子數(shù)目，因此提取3個(gè)公因子，提取的前3個(gè)公因子累積方差貢獻(xiàn)率為90.24%，損失了9.76%的信息，說(shuō)明這3個(gè)公因子可以基本反映香葉天竺葵不同部位12種無(wú)機(jī)元素的全部信息。

為了能夠更好地解釋變量，通過(guò)因子載荷矩陣旋轉(zhuǎn)使每個(gè)因子的載荷值盡可能地接近1和0兩個(gè)極值。其中因子載荷值越接近1，說(shuō)明其貢獻(xiàn)越大，表明相關(guān)性越顯著。通常因子載荷值大于0.5，即可認(rèn)為該因子與某一主成分顯著相關(guān)。

由表4可知，其中70.16%的貢獻(xiàn)率來(lái)自第1因子，10.61%的貢獻(xiàn)率來(lái)自第2因子，9.47%的貢獻(xiàn)率來(lái)自第3因子，結(jié)合方差最大法旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣分析結(jié)果(表5)，可以看出，第1因子表明和K(因子載荷0.97)、P(因子載荷0.92)、Na(因子載荷0.85)、S(因子載荷0.84)元素高度正相關(guān)，和Fe(因子載荷-0.93)、B(因子載荷-0.87)元素高度負(fù)相關(guān)，由于總方差50%以上的貢獻(xiàn)都來(lái)自第1因子，因此認(rèn)為K、P、Na、S、Fe、B元素是香葉天竺葵不同部位中的特征性元素。

圖1 香葉天竺葵不同部位12種無(wú)機(jī)元素聚類(lèi)圖

表4 香葉天竺葵不同部位12種無(wú)機(jī)元素的因子分析

3 討論與結(jié)論

植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的絕大部分養(yǎng)分由根系吸收，植物地上部分無(wú)機(jī)元素含量與土壤養(yǎng)分含量具有直接關(guān)系，但同時(shí)又受到自身營(yíng)養(yǎng)吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和分配等因素影響[30]。同一種無(wú)機(jī)元素在不同作物、不同品種、不同器官或部位中的含量差異很大[31]。本研究中，香葉天竺葵葉片中無(wú)機(jī)元素含量高低順序?yàn)镃a>K>P>S>Na>Mg>Fe>Cr>Mn>Zn>B>Cu>Ni，嫩枝中無(wú)機(jī)元素含量高低順序?yàn)镵>Ca>P>S>Na>Mg>Fe>Cr>Mn>Zn>B>Ni，老枝中無(wú)機(jī)元素含量高低順序?yàn)镵>Ca>P>S>Na>Mg>Cr>Fe>Mn>Zn>B>Ni，而Pb、Cd、Co、Mo、Se、Si元素在葉片、嫩枝和老枝中均未檢出，Cu元素僅在葉片中檢出，各無(wú)機(jī)元素在不同部位之間無(wú)統(tǒng)一的排列規(guī)律。與李大紅等[32]對(duì)香葉天竺葵葉片礦物元素的檢測(cè)結(jié)果相比，本研究P、Ca、Mn元素含量偏高，而B(niǎo)、Zn、Fe、Mg、Cu、K、Na、S、Si等元素含量偏低，這可能與所選樣本的生育期、種植土壤環(huán)境、栽培管理技術(shù)等因素有關(guān)。以往研究表明，無(wú)機(jī)元素含量與植物中的重要化學(xué)成分及藥理作用密切相關(guān)[33-35]，其中P和K元素與香葉天竺葵植株中精油類(lèi)物質(zhì)代謝與最終產(chǎn)物的形成密切相關(guān)[9]。因此，對(duì)香葉天竺葵不同部位無(wú)機(jī)元素含量分布規(guī)律的研究，可以為進(jìn)一步研究香葉天竺葵中的精油含量、活性成分、藥理作用等提供理論指導(dǎo)。在生產(chǎn)實(shí)踐中，根據(jù)不同土壤條件，通過(guò)均衡施肥、平衡施肥、精準(zhǔn)施肥達(dá)到改善香葉天竺葵中無(wú)機(jī)元素含量，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，提高香葉天竺葵精油產(chǎn)出率。

表5 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣

因子分析是指從眾多變量中找出隱藏的具有代表性的公因子，因此，變量之間是否存在相關(guān)性是進(jìn)行因子分析的前提。本研究中，由于Pb、Cd、Co、Mo、Se、Si、Cu元素僅在個(gè)別樣品中檢出，這7種元素與香葉天竺葵不同部位的相關(guān)性不顯著，因此進(jìn)行因子分析意義不大。通過(guò)對(duì)剩余12種無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行因子分析，篩選出K、P、Na、S、Fe和B元素是香葉天竺葵不同部位中的特征性元素。前人研究表明，植物中無(wú)機(jī)元素之間存在著復(fù)雜的協(xié)同作用或者拮抗作用，還可能存在補(bǔ)充替換關(guān)系[30]。如Ca和K元素存在拮抗作用[36]，而Ca和B元素存在協(xié)同作用[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，香葉天竺葵不同部位中無(wú)機(jī)元素之間存在復(fù)雜的相關(guān)性。B與Zn、Fe、Ni、Ca之間，Zn與Fe、Ni、Ca之間，F(xiàn)e與Ni、Ca之間，Mg與K、Na、P、S之間，K與Na、P、S之間，Na與P、S之間，P與S之間均存在顯著或極顯著正相關(guān)；B與Mg、K、Na、P、S之間，Zn與Mg、K、Na、P、S之間，F(xiàn)e與Mg、K、Na、P、S之間，Mg與Ni、Ca之間，Mn與Ca之間，Ni與K、Na、S之間，Ca與K、Na、P、S之間均存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。不同作物中Mg、P、K元素三者之間的正相關(guān)關(guān)系得到了許多研究的證實(shí)[38]，而其他無(wú)機(jī)元素間的相關(guān)性則不完全一致，甚至存在矛盾，可能是由于植物中無(wú)機(jī)元素含量受自身遺傳特性及各種環(huán)境條件等綜合因素的影響。

目前，聚類(lèi)分析方法已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)研究。聚類(lèi)分析方法具有主觀因素少、分類(lèi)結(jié)果科學(xué)客觀、可同時(shí)對(duì)多樣品多指標(biāo)進(jìn)行綜合分析等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用類(lèi)平均法，將香葉天竺葵不同部位分為兩類(lèi)，葉片單獨(dú)聚為第一類(lèi)，嫩枝和老枝聚為第二類(lèi)，說(shuō)明葉片與嫩枝、老枝在元素吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和分配方面具有一定選擇性。聚類(lèi)分析結(jié)果可為香葉天竺葵不同部位的不同用途提供數(shù)據(jù)參考。關(guān)于香葉天竺葵不同部位中的精油含量、化學(xué)成分、藥理作用及其與無(wú)機(jī)元素之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。