動物源性食品中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇快速檢測產(chǎn)品的穩(wěn)健性評價

喻俊磊,陳 沙，李雨露，李 晴，趙淑娟，蘭 偉

(江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院,江西 南昌 33000)

瘦肉精是一類人工合成的β-受體激動劑，因其可以提高瘦肉率和促進(jìn)動物生長，而被一些畜牧養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖促進(jìn)劑使用。根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異可分為克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。人食用了飼喂瘦肉精的禽畜產(chǎn)品后，會引起食物中毒，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第235號規(guī)定嚴(yán)禁在畜牧生產(chǎn)中使用各種β-受體激動劑類藥物[1-5]。目前，市售瘦肉精三聯(lián)快速檢測卡大多可同時測定豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。2015年新版《中華人民共和國食品安全法》[6]規(guī)定：“采用國家規(guī)定的快速檢測方法對食品進(jìn)行抽查檢測，被抽查人對檢測結(jié)果沒有異議的，可以作為行政處罰的依據(jù)”，在某種程度上給快檢結(jié)論賦予了法律效力?？鞕z方法有別于大型儀器方法，是一種包括樣品前處理，短時間內(nèi)能對相關(guān)質(zhì)量安全指標(biāo)得出檢測結(jié)果的技術(shù)[7-8]，食品快檢具有簡便、及時、現(xiàn)場可視化等特點(diǎn)，由此催生食品快檢行業(yè)及快速檢測方法的高速發(fā)展[9-10]。然而目前對快檢產(chǎn)品的評價屬于備案制時的準(zhǔn)入評價，而實(shí)際是快檢試劑應(yīng)該類似于交鑰匙工程，需要考慮運(yùn)輸、儲存、使用等環(huán)節(jié)的影響，目前缺乏這方面的評估研究。在基層監(jiān)管人員使用快檢產(chǎn)品進(jìn)行食品安全監(jiān)管時，普遍存在檢出率低的情況，這與監(jiān)督抽檢等平均不合格率結(jié)果相差較大[11]。本文選取β-受體激動劑快檢產(chǎn)品作為研究對象，通過實(shí)驗(yàn)對瘦肉精快檢產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)健性評估，從而建立完整的瘦肉精快檢產(chǎn)品穩(wěn)健性評估研究體系，用穩(wěn)健性評估來解決快檢產(chǎn)品不準(zhǔn)確的困惑,具有重大意義。同時為食品監(jiān)管部門購買和使用快檢產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，為快速檢測操作人員提供技術(shù)指導(dǎo)。

本研究以瘦肉精膠體金免疫層析試紙條的評價為切入點(diǎn)，系統(tǒng)性地研究膠體金免疫層析類食品快檢產(chǎn)品評價過程中具體的操作問題，主要包括不同溫濕度、貯存時間、模擬振動、樣品基質(zhì)干擾、不同熟練工操作等。對快檢產(chǎn)品穩(wěn)健性進(jìn)行系統(tǒng)性的評價。在國家規(guī)范內(nèi)，做好產(chǎn)品評價過程中的每一個細(xì)節(jié)，發(fā)現(xiàn)存在的問題并探討在實(shí)際工作中的解決方法。本研究可為各級監(jiān)管部門提供實(shí)踐依據(jù)，為快檢產(chǎn)品評價提供技術(shù)借鑒，有利于快檢市場的規(guī)范化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，由國家糧食局科學(xué)研究院提供)；同位素內(nèi)標(biāo)：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、甲醇(色譜純，由SCHARLAB S.L.公司生產(chǎn))、乙醇(分析純，由西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn))、NY針頭式過濾器(WondaDisc Ⅱ，由SHIMADZU-GL公司生產(chǎn))、磷酸緩沖液(10 mmol/L,pH值7.4，由Sigma公司生產(chǎn))。

本次評價實(shí)驗(yàn)使用的瘦肉精快速檢測試紙條/卡從市場上購買。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜質(zhì)譜儀(由美國安捷倫公司生產(chǎn))、C18色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18，由Waters公司生產(chǎn))、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9420A，由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(由美國Millipore公司生產(chǎn))、電子天平(QUINTIX213-1CN，由賽多利斯科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、振蕩器(MMV-1000 W，由上海愛朗儀器有限公司生產(chǎn))、磁力攪拌器(RCT basic，由IKA公司生產(chǎn))。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥97%。

表1 3種標(biāo)準(zhǔn)品參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量

1.4 方法

1.4.1 檢測人員篩選和培訓(xùn) 評價人員由具有一定檢驗(yàn)基礎(chǔ)與能力的人員組成,并對其進(jìn)行快檢基本知識、膠體金快速檢測技術(shù)基本原理和實(shí)驗(yàn)技能方面進(jìn)行培訓(xùn)。為保證評價過程的客觀與公正,人員分成2組,一組人員負(fù)責(zé)盲樣的制備與定值,一組人員負(fù)責(zé)快檢產(chǎn)品的測試評價,2組人員互不交叉，另外一組人員則從來沒有接觸過快檢產(chǎn)品。

1.4.2 添加回收實(shí)驗(yàn) 為確保儀器驗(yàn)證盲樣均勻性實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在開展盲樣制備之前先做豬肉組織中β-受體激動劑添加回收實(shí)驗(yàn)。選取不含瘦肉精的豬肉組織樣品，添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，然后用儀器分析，檢測其含量，并計(jì)量回收率。具體步驟如下：(1)選取空白豬肉樣本；(2)制備9個樣品，平均分成3組。每組樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，3個濃度水平分別為0.1、0.5、1.0 μg/kg；(3)以GB/T 22286—2008[12]的方法——高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對上述樣品進(jìn)行檢測，并計(jì)量樣品的添加回收率。

1.4.3 盲樣制備 根據(jù)《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》[10]，制備盲樣的基質(zhì)應(yīng)與實(shí)際食品樣品所含物質(zhì)相似，本次評價實(shí)驗(yàn)所用基質(zhì)是豬瘦肉。該規(guī)范同時對測試水平提出了要求，測試水平一般應(yīng)包括食品基質(zhì)空白樣品，標(biāo)準(zhǔn)方法檢出水平(或者標(biāo)準(zhǔn)限量值)的0.5、1、2倍水平或者其他可檢測區(qū)分的水平(不少于3個)，或者方法標(biāo)稱檢出限0.5、1、2倍水平或者其他可檢測區(qū)分的水平(不少于3個)。本次評價實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個測試水平，分別為空白樣品、≤0.1 μg/kg(陰性樣品)、0.5 μg/kg(陽性樣品1)、1.0 μg/kg(陽性樣品2)。

從市場上購買瘦肉樣品，經(jīng)儀器分析確證，克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇都未被檢出，作為空白樣品。向豬肉組織中加入克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，磁力攪拌器室溫條件攪拌12 h，制備成上述4種濃度的樣品，再用儀器檢測盲樣的均勻性和穩(wěn)定性。

1.4.4 盲樣的均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn) 為保證快檢評價實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和公正性，根據(jù)規(guī)范“盲樣必須進(jìn)行批內(nèi)均勻性檢查，對于一定時間范圍內(nèi)檢測的樣品，需要進(jìn)行穩(wěn)定性檢查，保證在評價期限內(nèi)樣品穩(wěn)定”。將“1.2.2”節(jié)制備的各濃度水平的盲樣進(jìn)行分裝(5 g/管)，先用儀器進(jìn)行均勻性檢測，每個樣品在重復(fù)條件下檢測3次。采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用的軟件為IBM SPSS Statistics 22(International Business Machines Corporation)，通過F-檢驗(yàn)驗(yàn)證樣品的均勻性[10]。

將其余樣品置-20 ℃儲存，分別間隔1周、2周、3周取出，每次取出3個樣品，每個樣品重復(fù)檢測3次。依據(jù)CNAS-GL003[13]規(guī)定，將不同儲存時間的檢測平均值與初始檢測平均值進(jìn)行一致性比較，以考查樣品在評價期內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4.5 快檢產(chǎn)品穩(wěn)健性評價與結(jié)果統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置不同的運(yùn)輸溫度、濕度、2個存放時間、模擬振動的有無、樣品前處理溫度設(shè)置、不同基質(zhì)對快檢產(chǎn)品結(jié)果的影響以及操作熟練程度的影響，設(shè)置運(yùn)輸時的溫度、濕度、振動等單一因素和多因素交叉復(fù)合變量，模擬常規(guī)溫度的極限條件下的溫度(0、35 ℃)條件，用快檢產(chǎn)品檢測陽性樣品，同時用儀器分析結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)參照，統(tǒng)計(jì)分析溫度因素對最終檢測結(jié)果的影響。同上，設(shè)置2處典型氣候的濕度(42%、80%)條件，統(tǒng)計(jì)分析濕度因素對最終檢測結(jié)果的影響?？鞕z產(chǎn)品經(jīng)過真實(shí)的快遞線路和搖床模擬振蕩，再檢測陽性樣品，同時以儀器分析結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)參照，分析運(yùn)輸振動因素對檢測結(jié)果的影響。統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)輸條件因素對最終檢測結(jié)果的影響。前處理對樣品進(jìn)行不同溫度(80、100 ℃)處理，保持溫度和濕度在同一水平考察前處理溫度對快檢產(chǎn)品結(jié)果的影響，不同基質(zhì)和操作熟練程度操作步驟同上。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置50個快檢產(chǎn)品，最終以陽性率來評價快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

向陰性瘦肉樣品(不含瘦肉精)中添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，添加濃度水平分別為0.25、0.5、1.0 μg/kg，每個濃度水平取3個重復(fù)樣品，按GB/T 22286─2008進(jìn)行檢測。添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。此添加回收實(shí)驗(yàn)的回收率范圍為87.7%～112.3%，符合GB/T 27417—2017[14]中“方法回收率偏差范圍”。

表2 豬肉組織中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率

注：*表示3次重復(fù)。

2.2 樣品的均勻性檢驗(yàn)

按照CNAS-GL003：2018對樣品的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。首先對各濃度水平的盲樣均勻性進(jìn)行檢測。然后，采用單因素方差分析法(F-檢驗(yàn))對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，查看GB/T 15000.5─1994[15]的附錄B“F檢驗(yàn)法臨界值表”，SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的F值，均勻性檢測結(jié)果見表3、表4。3組濃度水平的F值均小于Fcrit，P值均大于0.05，此結(jié)果表明在顯著水平α=0.05時，同一濃度水平的所有樣品間無顯著性差異，即制備的樣品是均勻的。

2.3 樣品的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

盲樣制備完成后置于-20 ℃條件下保存，從中取出用于穩(wěn)定性檢測的樣品，每次取出3個樣品，按GB/T 22286─2008方法進(jìn)行檢測，每隔1周檢測1次，每個樣品重復(fù)檢測3次，檢測結(jié)果見表5。

表3 3種濃度水平樣品的均勻性檢測結(jié)果

表4 測試樣品的均勻性分析結(jié)果

表5 測試樣品的穩(wěn)定性檢測結(jié)果

將不同儲存時間樣品的平均值與初始檢測平均值進(jìn)行一致性比較，按照CNAS-GL003：2018中穩(wěn)定性檢驗(yàn)的要求，采用t檢驗(yàn)法“二個平均值之間的一致性”公式計(jì)算t值，見表6。查GB/T 15000.5─1994的附錄F“T檢驗(yàn)法分位數(shù)表”，t0.05(37)=2.026，t值都大于2.026，表明各儲存時間的檢測結(jié)果與初始檢測結(jié)果之間存在顯著性差異。但是從各時間段檢測結(jié)果的平均值表現(xiàn)出變異程度較小。快檢產(chǎn)品本身只是對目標(biāo)化合物做一個初步篩查，對化合物的含量要求不須高度精確。因此，以本研究中的方法制備樣品，在短時間內(nèi)完成快檢產(chǎn)品的評價，對評價結(jié)果的影響會較小。

表6 測試樣品的穩(wěn)定性分析結(jié)果

注：(1)變量1，樣品初始的檢測結(jié)果。變量2，不同時間段穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果；(2)T1為1周，T2為2周，T3為3周。

2.4 產(chǎn)品的穩(wěn)定性評價檢測與結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本研究從儲存溫度(0、35 ℃)、濕度(42%、80%)、月份(7月、12月)、模擬振動條件(有、無)、樣品前處理加熱溫度(80、100 ℃)、基質(zhì)干擾(豬肉組織和尿液)、操作熟練程度(新人、熟練工)等7個方面對快檢產(chǎn)品的穩(wěn)健性進(jìn)行評價，在設(shè)置溫度變量時，其他條件保持在同一水平，即濕度在42%，月份為7月，不設(shè)振動條件，樣品前處理加熱溫度為80 ℃的豬肉組織，并采用熟練工進(jìn)行操作，結(jié)果見表7。每一組變量分別進(jìn)行50次平行試驗(yàn)得出陽性率，即檢出率。

表7 不同存儲條件對快檢產(chǎn)品的穩(wěn)健性評價

注：*樣品嚴(yán)格按快檢產(chǎn)品說明書進(jìn)行前處理、檢測和判讀，平行重復(fù)測試50次，得出陽性率。

2.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與討論

通過制備的樣品對快檢產(chǎn)品進(jìn)行測試，按照“快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表”對檢測結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：瘦肉精快檢產(chǎn)品在溫度分別為0 ℃和35 ℃貯存時，檢出率為94%和96%，濕度為42%和80%時的檢出率為96%、82%，模擬月份在7月和12月的檢出率為96%和85%，快檢產(chǎn)品在模擬振動和不振動條件下的檢出率為93%和96%，樣品前處理加熱溫度分別為80 ℃和100 ℃時的檢出率為96%和98%，不同基質(zhì)樣品包括豬肉組織和豬尿液的檢出率為96%和88%，不同操作熟練程度的檢出率為96%和80%。由上述結(jié)果可看出，快檢產(chǎn)品在不同的貯存溫度和濕度環(huán)境下運(yùn)輸對檢測結(jié)果的影響在15%以上。模擬不同的時間段主要是7月和12月時，檢出率95%。使用月份對快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性影響不大。運(yùn)輸過程中的振動有無對快檢產(chǎn)品的檢測結(jié)果影響不大，檢出率可達(dá)93%。前處理加熱溫度對快檢產(chǎn)品影響較大，樣品在前處理過程中加熱80 ℃時的陽性率為88%，而100 ℃時的檢出率可達(dá)95 ℃，可見充分加熱處理樣品可以將瘦肉精有效的釋放，有利于富集濃縮處理液，檢出率也更高。同時不同的基質(zhì)對快檢試劑的影響也較大，采用豬肉組織陽性樣品進(jìn)行檢測時檢出率為81%，而基質(zhì)為尿液時的陽性率為96%。對不同熟練程度的快檢人員使用產(chǎn)品的陽性率也有差異，熟練操作快檢產(chǎn)品的人員陽性率可達(dá)到96%，而新成員則為80%左右。由此得出豬肉組織溫度35 ℃、濕度42%，前處理溫度為100 ℃并采用熟練工操作時，樣品的檢出率高達(dá)95%以上，表明快檢產(chǎn)品在此條件下的穩(wěn)定性更高。

3 結(jié)論

本研究采用豬肉基質(zhì)加標(biāo)的方法制備3種不同濃度水平的瘦肉精樣品，對市售膠體金免疫層析試紙條/卡進(jìn)行評價測試。根據(jù)評價結(jié)果可知，制備的盲樣均勻性良好，由此可以看出快檢產(chǎn)品在貯存和運(yùn)輸過程對產(chǎn)品的檢測結(jié)果具有一定影響，樣品的前處理加熱條件是影響快檢產(chǎn)品穩(wěn)定性的最大因素，其次是溫度和濕度。因此影響快檢產(chǎn)品穩(wěn)健性的因素，由大到小依次為：樣品的前處理?xiàng)l件>樣品前處理的熟練程度>樣品的基質(zhì)>溫度>濕度>快檢產(chǎn)品的貯存和運(yùn)輸過程。本文建議在快檢產(chǎn)品的使用過程中應(yīng)該充分考慮快檢產(chǎn)品儲存運(yùn)輸條件，和使用過程中控制好產(chǎn)品的溫濕度同時，采用熟練人員操作產(chǎn)品可以大大提高產(chǎn)品的準(zhǔn)確率。