★ 林瑤楊莎莎 劉婷 許茜 付建華 蔡晶

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的主要病理特征是黑質(zhì)紋狀體致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，其發(fā)病的重要機(jī)制之一是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[1]。在細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，PI3K/ Akt因參與調(diào)控凋亡蛋白和凋亡基因發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用而受到重視[2]。已有研究表明，多種PD模型及PD患者均存在PI3K/ Akt信號(hào)通路的減弱或異常調(diào)節(jié)[3-4]。

肉蓯蓉(Herba Cistanche)為肉蓯蓉屬植物干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，能補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血，被譽(yù)為“沙漠人參”。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉能調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，減輕多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]。但是肉蓯蓉是否通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肉蓯蓉對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)以及黑質(zhì)紋狀體中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討肉蓯蓉減輕多巴胺神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和普通級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK2014-0012，具體為SD健康雄性大鼠(SPF 級(jí))，6～7周齡，數(shù)量48只，每只體重(210±30)g。

1.2 試劑與儀器 肉蓯蓉顆粒劑(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院)；魚(yú)藤酮(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)R3875)；葵籽油(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)S5007)；PI3K 抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)19H8)；Akt 抗體(武漢三鷹，批號(hào)66009-1：)；Bcl-2抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)15071：)；Bax抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)5023：)；β-actin(武漢三鷹，批號(hào)60203)；電泳槽與轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)；5417R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司)；DU-650 型蛋白分析儀(美國(guó) Beckman 公司)；Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組 6～7周齡的SPF級(jí)SD雄性大鼠48只，隨機(jī)法分為正常組、溶劑對(duì)照組、模型組以及肉蓯蓉低、中、高劑量組，每組各8只。普通環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水。

2.2 造模與干預(yù) 溶劑對(duì)照組給予頸背部皮下注射葵花油乳化液(1.5 mg/kg/d)，1次/d，連續(xù)14d；模型組、肉蓯蓉低、中、高劑量組頸背部皮下注射魚(yú)藤酮葵花油乳化液(1.5 mg/kg/d)建立PD模型，注射7d休息1天，共15d，造模結(jié)束后按照行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)選取造模成功的大鼠(造模方法及行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)均參照陳忻等[6]的方法)。造模成功后，肉蓯蓉低、中、高劑量組分別給予0.54 g/kg/d、1.08 g/kg/d、2.16 g/kg/d肉蓯蓉水煎劑灌胃(肉蓯蓉低、中、高劑量根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定[15])，1次/d，連續(xù)14d。正常組、溶劑對(duì)照組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃，頻次同肉蓯蓉組。給藥劑量均按人和大鼠間體表面積折算的等效劑量給藥。

2.3 行為學(xué)檢測(cè) 各組進(jìn)行肉蓯蓉干預(yù)后，分別在第3、7、14天進(jìn)行行為學(xué)的步幅試驗(yàn)，同時(shí)記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。步幅試驗(yàn)操作方法如下：制作不透光的木盒子，帶有長(zhǎng) 42 cm，寬4.5 cm，高10 cm的跑道，在跑道上放置寬4.5 cm，長(zhǎng)40 cm的白紙。將大鼠的前爪涂上墨水，訓(xùn)練大鼠在跑道上行走并讓其穿過(guò)盒子，測(cè)量白紙上大鼠2個(gè)前爪印記之間的距離(取腳印的中心)，此即步幅。每次測(cè)量3個(gè)最長(zhǎng)的步幅(對(duì)應(yīng)大鼠行走的最大速度)。 若出現(xiàn)大鼠在行走過(guò)程中停止，或者有明顯減速的情形，則重新進(jìn)行測(cè)試。

2.4 實(shí)驗(yàn)取材 最后一次給藥的12h后，從每組中隨機(jī)抽取6只大鼠，采用乙醚麻醉，迅速斷頭處理，于冰盤(pán)上提取以中腦黑質(zhì)為主的腦組織，腦組織表面的血液用冰0.9% 氯化鈉溶液沖洗干凈，殘余液體用濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 提取蛋白 將樣品從-80 ℃冰箱中取出，稱(chēng)重后放入研磨器研碎，按12.5μL/mg加入RIRA裂解液，冰上裂解30min，使用1mL注射器反復(fù)抽吸20次。接著將樣品放入4℃離心機(jī)中離心15min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000r/min，之后每組樣品各吸取30μL上清液到新的離心管中，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，其余上清液以4∶1的比例加入5×buffer溶液，混合均勻后，在水浴鍋中煮沸10min，之后置于-80℃冰箱備用。

2.6 Western Blot 法檢測(cè) PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30μg/μL，將樣品加入到10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，按1∶1000的稀釋比例加入一抗PI3K、Akt、Bcl-2、Bax。隔天取出條帶用二抗(1∶2000)孵育1h，TBST清洗后，采用ECL試劑盒顯影并成像，用Image Lab軟件進(jìn)行半定量分析，并記錄相應(yīng)條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 6組大鼠步幅比較 肉蓯蓉干預(yù)后第3、7、14天，模型組大鼠步幅比正常組明顯下降(P<0.01)；肉蓯蓉給藥后各組步幅有顯著性差異，其中肉蓯蓉干預(yù)第7天，高劑量組步幅較模型組有顯著增加(P<0.01)；而肉蓯蓉干預(yù)14天后，中、高劑量組步幅較模型組均出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3.2 6組大鼠黑質(zhì)紋狀體PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值比較 與正常組比較，模型組PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax值均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。而與模型組相比，肉蓯蓉低、中、高劑量組PI3K表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)，中劑量組Akt明顯升高(P<0.01)，低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax值均顯著升高(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖1。

表1 6組大鼠步幅比較±s,n=8)

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

表2 6組大鼠黑質(zhì)紋狀體PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

依次為：正常組，溶劑對(duì)照組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組

4 討論

PD是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要的發(fā)病機(jī)制是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，有效抑制或減少細(xì)胞凋亡是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的重要手段。中醫(yī)理論認(rèn)為， PD雖然病位在腦，但是病機(jī)實(shí)為腎虛髓空，可通過(guò)補(bǔ)益腎臟來(lái)濡養(yǎng)腦髓。而肉蓯蓉性甘、咸，溫；歸腎、大腸經(jīng)；補(bǔ)腎陽(yáng)，益精血，潤(rùn)腸通便，是傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥[7]。現(xiàn)有的研究已表明，肉蓯蓉可以抗氧化、抗衰老，能夠提高細(xì)胞中多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，起到神經(jīng)保護(hù)作用[8]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)多味補(bǔ)腎中藥如淫羊藿、菟絲子、肉蓯蓉等均可增加細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量，減少相關(guān)神經(jīng)凋亡因子含量，從而抑制多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其中又以肉蓯蓉作用最為突出[9]。

PI3K/Akt是一條經(jīng)典的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，PI3K/AKT激活后可以調(diào)節(jié)其下游的凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2 蛋白和Bax蛋白，使Bcl-2/Bax值升高，發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[10-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉干預(yù)后第7天，高劑量組步幅較模型組有顯著增加，而肉蓯蓉干預(yù)后第14天，中、高劑量組的步幅均出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，提示一定劑量的肉蓯蓉作用一段時(shí)間后能改善PD模型大鼠的行為障礙，這與本課題組之前的研究結(jié)論一致[15]。同時(shí)Western Blot結(jié)果顯示，模型組PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)、Bcl-2/Bax值均較正常組顯著降低，Bax表達(dá)較正常組升高；給予肉蓯蓉后，與模型組相比，給藥組PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)、Bcl-2/Bax值升高，Bax水平降低，提示肉蓯蓉可能是通過(guò)影響PI3K/Akt信號(hào)通路，增加Bcl-2表達(dá)、降低Bax表達(dá)，從而升高Bcl-2/Bax比值，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉中劑量組無(wú)論是步幅實(shí)驗(yàn)，還是PI3K、Akt、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)的變化均表現(xiàn)明顯，可考慮將這個(gè)劑量作為下一步實(shí)驗(yàn)的最適濃度。另外，由于要確定肉蓯蓉對(duì)PI3K/Akt通路的激活作用，需要使用通路抑制劑進(jìn)行研究，這可作為下一步深入探討機(jī)制的思路。