蜂蜜酒對(duì)腸道微生物和腸黏膜免疫功能的影響

楊曉婷，陳 濤，楊曉滿，趙可及，陸筑鳳，李加友

（1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001；2.宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇宿遷 223800）

蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜，在蜂巢中釀制而成。《神農(nóng)本草經(jīng)》把“石蜜、蜂子、蜜蠟”列為上品，指出其有“除百病、和百藥”的作用，且“多服久服不傷人”[1]，可見蜂蜜的保健功能很早就被認(rèn)識(shí)到。隨著蜂蜜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，高附加值蜂蜜產(chǎn)品的開發(fā)成為一種趨勢(shì)。蜂蜜酒是以蜂蜜加水稀釋后經(jīng)特殊工藝生產(chǎn)的發(fā)酵酒，含有多種人體必需的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，有極高的營養(yǎng)價(jià)值；酒精含量在10%vol～14%vol，不含甲醇和甲醛[2]；口感獨(dú)特，備受消費(fèi)者的青睞。因此，評(píng)估蜂蜜酒的生物學(xué)功效，并與其他市售同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，為蜂蜜酒的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

腸道微環(huán)境主要包括4種屏障：微生物形成的生物屏障、腸黏膜免疫屏障、消化液及抑菌物質(zhì)等形成的化學(xué)屏障和上皮與細(xì)胞形成的機(jī)械屏障[3]。本文主要研究生物屏障和腸黏膜免疫屏障，腸道表面定殖著大量的微生物，它們共同參與腸道吸收、免疫調(diào)節(jié)等過程，共同維持腸道的健康與平衡。腸黏膜堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是腸道吸收消化的標(biāo)志性酶類物質(zhì)，與腸道微生物的組成和豐度存在密切關(guān)系，當(dāng)腸道中革蘭氏陰性菌多時(shí)，腸堿性磷酸酶活性增高，說明腸道中潛在的致病菌多[4]。此外腸黏膜免疫屏障中分泌型免疫球蛋白SIgA也會(huì)參與腸道免疫調(diào)節(jié)，抵御病原菌的侵害，防止腸道炎癥的產(chǎn)生，分泌型免疫球蛋白SIgA含量越高，說明腸黏膜免疫屏障越強(qiáng)[5]。

目前關(guān)于酒精飲品生物學(xué)效應(yīng)的評(píng)價(jià)很多，大部分從肝功能著手，探究酒類物質(zhì)對(duì)肝臟乙醇脫氫酶、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響[6-7]，而近些年發(fā)現(xiàn)腸道和宿主健康存在密切的聯(lián)系[8-9]，因此使用腸道相關(guān)指標(biāo)來評(píng)價(jià)蜂蜜酒對(duì)健康的影響非常重要，本文擬就蜂蜜酒對(duì)小鼠生長、腸道微生物和宿主免疫因子的影響進(jìn)行研究，進(jìn)而初步揭示蜂蜜酒對(duì)人體腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)小鼠：以4周齡的雌性昆明小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分成4組，每組5只重復(fù)，分別命名為純凈水組、酒精組、蜂蜜水組、蜂蜜酒組，其中酒精組為陰性對(duì)照。設(shè)置處理小鼠的酒精最終濃度是0.11%vol，該濃度對(duì)小鼠生理活動(dòng)沒有任何影響，將試驗(yàn)材料加入至小鼠飲用水中正常喂養(yǎng)，處理30 d，每只小鼠飲水量為9～12 mL/d。

試劑及耗材：陰性對(duì)照為食用酒精（酒精度55%vol）。蜂蜜水是將市售蜂蜜（糖度40°Bx）原液與水按1∶4稀釋而成，蜂蜜來源于浙江省嘉興市平湖養(yǎng)蜂場，主要成分為總糖（葡萄糖和果糖）80%，水15%，還有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、果膠、維生素等；蜂蜜酒是以上述配制的蜂蜜水為原材料，加入安琪酵母發(fā)酵而得，酒精濃度為14%vol，主要成分為酒精14%vol、總氨基酸1.5 g/L、礦物質(zhì)1.1 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 食物轉(zhuǎn)化率計(jì)算

1.2.2 肝臟切片觀察

將喂養(yǎng)30 d的小鼠解剖，取肝臟組織用10%中性甲醛固定，完成后進(jìn)行梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色后用中性樹脂膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)。

1.2.3 腸道微生物活菌計(jì)數(shù)

將喂養(yǎng)30 d的小鼠糞便收集后于厭氧箱中直接進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇運(yùn)用不同的培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳酸桿菌（Lactobacillus）進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，選擇培養(yǎng)基平板分別為麥康凱培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌使用完全厭氧培養(yǎng)。

1.2.4 堿性磷酸酶活性測(cè)定

小鼠喂養(yǎng)30 d后斷頸，解剖得小腸組織，取小腸前1/3段，用0.9%生理鹽水洗掉殘?jiān)?，用?xì)胞刮刀刮取小腸黏液于1.8 mL無菌生理鹽水中，稱重，并加入2顆鋼珠勻漿，3000 r/min離心20 min，收集上清液，速凍分裝保存。將所取的小腸黏液層上清液從-80℃取出置于冰上至融化，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黏液層上清液中的總蛋白。同時(shí)將上清液稀釋10倍后，用堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司）檢測(cè)，通過計(jì)算每克蛋白與酚反應(yīng)的金氏單位來定量堿性磷酸酶活性。

1.2.5 腸黏膜SIgA含量測(cè)定

將上述所取的小腸黏液層上清液從-80℃取出置于冰上至融化，按照分泌型免疫球蛋白SIgA酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒來源于南京建成生物工程有限公司。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad統(tǒng)計(jì)軟件，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜酒對(duì)肝臟的影響（圖1）

圖1 不同處理組小鼠肝臟切片的顯微對(duì)比

長期過量飲酒會(huì)對(duì)肝臟造成損傷，通過對(duì)喂養(yǎng)30 d后小鼠的肝臟進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蜂蜜水組、蜂蜜酒組的小鼠肝臟顏色鮮紅，柔軟有彈性，而陰性對(duì)照（酒精組）的小鼠肝臟顏色偏黃，有稍微的硬化。切片觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），酒精組肝臟胞腔中出現(xiàn)大小不等的空泡，邊界清晰，屬于肝細(xì)胞脂肪變性，而其他處理組的肝臟細(xì)胞排列均勻，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞與細(xì)胞間界限清晰，說明蜂蜜酒對(duì)小鼠肝臟沒有明顯的影響。

2.2 蜂蜜酒對(duì)食物轉(zhuǎn)化率的影響（圖2）

圖2 不同處理對(duì)小鼠食物轉(zhuǎn)化率的影響

為探究不同處理組對(duì)小鼠生長的影響，每5天記錄其飲食量和生長情況。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組（酒精組）的小鼠食物轉(zhuǎn)化率明顯低于純凈水組，在第5天時(shí)兩者相差11.9%；而蜂蜜水組和蜂蜜酒組的小鼠食物轉(zhuǎn)化率明顯高于純凈水組，在第5天時(shí)差異最明顯。說明酒精會(huì)降低小鼠的食物轉(zhuǎn)化率，影響其正常生長；而蜂蜜水和蜂蜜酒會(huì)增加食物轉(zhuǎn)化率以促進(jìn)生長，可能是因?yàn)榉涿鬯头涿劬浦芯幸欢康臓I養(yǎng)物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)，可以抵抗酒精對(duì)食物消化的負(fù)面作用。

2.3 蜂蜜酒對(duì)腸道微生物生長的影響（圖3）

圖3 不同處理對(duì)小鼠腸道微生物生長的影響

為比較各種處理對(duì)小鼠腸道微生物的作用，通過活菌計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠糞便中大腸桿菌的含量（圖3A）顯著升高（p＜0.05），而蜂蜜酒組大腸桿菌含量顯著下降（p＜0.05），說明蜂蜜酒對(duì)腸道潛在致病菌（大腸桿菌）有顯著的抑制作用。酒精組（圖3B）小鼠糞便中雙歧桿菌含量顯著降低（p＜0.05），蜂蜜水組和蜂蜜酒組處理后雙歧桿菌含量極顯著升高（p＜0.01），說明蜂蜜水和蜂蜜酒都能促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的生長。就腸道中乳酸桿菌的變化而言（圖3C），酒精組的乳酸桿菌生長受到極顯著抑制（p＜0.01），而蜂蜜酒組的乳酸桿菌和純凈水組比較，沒有顯著的影響（p＞0.05），說明蜂蜜酒對(duì)乳酸桿菌的含量沒有顯著影響。因此研究結(jié)果表明，蜂蜜酒有改善腸道微生物的作用。

2.4 蜂蜜酒對(duì)腸堿性磷酸酶活性的影響（圖4）

圖4 不同處理對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

為探究各種處理對(duì)小鼠腸堿性磷酸酶含量的影響，實(shí)驗(yàn)處理后取各組小鼠腸黏膜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)（圖4）酒精組小鼠腸堿性磷酸酶活性顯著上升（p＜0.05），蜂蜜水組腸堿性磷酸酶活性沒有顯著變化（p＞0.05），而蜂蜜酒處理小鼠30 d后，AKP活性顯著性降低（p＜0.05）。堿性磷酸酶是腸道消化吸收的關(guān)鍵酶，其活性與腸道病原菌的含量密切相關(guān)，當(dāng)其含量降低時(shí)，說明腸道中病原菌受到抑制，炎癥產(chǎn)生概率小。因此飲用蜂蜜酒對(duì)腸道病原菌有一定的抑制作用。

2.5 蜂蜜酒對(duì)腸黏膜SIgA含量的影響（圖5）

圖5 不同處理對(duì)腸黏膜SIgA含量的影響

腸黏膜免疫球蛋白SIgA是腸道黏膜屏障的主要效應(yīng)因子，其含量升高說明腸黏膜的穩(wěn)定性、免疫能力增強(qiáng)，抑制腸道炎癥和感染的發(fā)生[11]，相反則說明腸黏膜免疫處于抑制狀態(tài)，有損腸道健康。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠腸道SIgA含量顯著下降（p＜0.05），小鼠腸黏膜免疫力低下；而蜂蜜酒組腸黏膜SIgA有顯著提升（p＜0.05），說明飲用蜂蜜酒能增強(qiáng)腸道免疫能力，抑制腸炎的產(chǎn)生，保護(hù)腸道。相比較而言，蜂蜜水對(duì)腸黏膜SIgA的促進(jìn)作用弱于蜂蜜酒，說明蜂蜜水經(jīng)發(fā)酵后的產(chǎn)物——蜂蜜酒對(duì)宿主的保健能力更強(qiáng)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估了蜂蜜酒對(duì)小鼠生理、腸道健康的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期飲用蜂蜜酒對(duì)肝臟沒有顯著的負(fù)面影響，同時(shí)還能提高小鼠的食物利用率，促進(jìn)生長，提高免疫機(jī)能，具體原因可能包括以下幾點(diǎn)：

（1）研究表明，低劑量的酒精會(huì)增強(qiáng)腸道通透性[12]，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；但是，相同酒精濃度的酒精組的食物利用率卻很低，說明酒精對(duì)小鼠生長具有其他負(fù)作用，導(dǎo)致小鼠食物利用率低，而蜂蜜中含有抵抗酒精負(fù)面作用的生物學(xué)活性成分。

（2）蜂蜜水經(jīng)過釀造加工而成的蜂蜜酒保留了原有的益生成分[13]，如氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等，這些益生成分對(duì)腸道微生物具有改善作用，促進(jìn)有益菌生長的同時(shí)抑制潛在致病菌。有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌在免疫調(diào)節(jié)、降低血液中膽固醇、產(chǎn)生代謝物抑制有害菌的侵染方面具有重要作用[14]，而腸道中潛在致病菌大腸桿菌含量較高時(shí)會(huì)引起腸道炎癥的產(chǎn)生，導(dǎo)致腹瀉[15]。腸道微生物的組成和相對(duì)豐度直接與腸道的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[16]。因此，蜂蜜酒可以通過改善腸道微生物的組成促進(jìn)食物的消化吸收，增加食物利用率，促進(jìn)生長。

（3）飲用蜂蜜酒增強(qiáng)腸道生物屏障和腸黏膜免疫功能。

其一，腸道微生物形成的生物屏障影響腸堿性磷酸酶的活性[17]，而腸堿性磷酸酶參與腸道的消化吸收和免疫平衡的調(diào)節(jié)。正常菌群中存在大量的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、變形桿菌等，這些陰性菌表面的脂多糖在腸道中的濃度也相對(duì)較高，當(dāng)其進(jìn)入血液循環(huán)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥，甚至休克，而腸黏膜堿性磷酸酶會(huì)催化脂多糖去磷酸化，間接抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18]，陰性菌含量越低，堿性磷酸酶活性越低，腸免疫能力越強(qiáng)[19]。研究結(jié)果表明，蜂蜜酒處理小鼠后，大腸桿菌的含量顯著降低（p＜0.05），與此同時(shí)腸黏膜堿性磷酸酶的活性顯著下降（p＜0.05），該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明蜂蜜酒對(duì)腸道具有保護(hù)作用。

其二，腸黏膜SIgA是腸道黏膜屏障的主要效應(yīng)因子，由漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生，參與形成腸黏膜的穩(wěn)定性、防止腸道感染的發(fā)生[20]。陳麗梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌YK-1R飼養(yǎng)斷奶仔豬，能增加菌群多樣性及提高SIgA的分泌，增強(qiáng)腸道免疫能力，促進(jìn)生長。賈玉臣等[22]用瑞士乳酸桿菌灌胃小鼠，腸黏膜SIgA含量顯著升高，腸道免疫能力明顯增強(qiáng)，說明SIgA顯著增高能提高腸道免疫功能，促進(jìn)腸道消化吸收，提高食物轉(zhuǎn)化率。同時(shí)此前相關(guān)研究也證明SIgA的分泌與腸道微生物之間也存在密切的關(guān)系[23]。腸道益生菌的定殖促進(jìn)了SIgA的分泌，而SIgA的分泌同時(shí)也會(huì)促進(jìn)益生菌的定殖，兩者相互作用，共同維持腸道健康，促進(jìn)生長。本文試驗(yàn)結(jié)果也表明，蜂蜜酒能顯著改善腸道微生物的相對(duì)豐度，促進(jìn)有益菌雙歧桿菌、抑制潛在致病菌大腸桿菌的生長，同時(shí)蜂蜜酒處理組的腸黏膜免疫球蛋白SIgA的含量也顯著增加（p＜0.05），與前人研究結(jié)果一致。因此蜂蜜酒可以通過提高腸道免疫功能，抵御病原菌入侵，促進(jìn)宿主健康。

綜上所述，蜂蜜酒可以通過改善腸道微生物和腸黏膜免疫來促進(jìn)宿主健康，與蜂蜜水相比而言對(duì)腸道保健效果更明顯。目前通過改善飲食來調(diào)理腸道微生物成為當(dāng)下維持健康生活狀態(tài)的首選方式[24-25]，我們的研究工作為蜂蜜產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)和蜂蜜酒的生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。