陳 雪，馮 莉，秦 義，2，劉延琳，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

冰葡萄酒俗稱冰酒，指在氣溫低于-7 ℃條件下，葡萄經(jīng)過自然冷凍、采摘、壓榨、濃縮后釀造的葡萄酒[1-2]。其酒色如金，具有花香、柑橘和蜂蜜等類香氣，口感圓潤，久有余香[3-4]，但在冰酒的生產(chǎn)過程中存在揮發(fā)酸（volatile acid，VA）含量高的問題，國際和加拿大的法律規(guī)范允許冰酒中最高VA含量為1.3 g/L[1]，我國國標GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》要求冰酒中VA含量≤2.1 g/L。乙酸是葡萄酒中揮發(fā)酸的主要組成成分[5]，對葡萄酒風味具有不良影響。多數(shù)冰酒的揮發(fā)酸超標，影響冰酒的香氣，破壞冰酒的質(zhì)量。

冰葡萄汁經(jīng)冷凍濃縮后含糖量和含酸量高，致使在冰酒的釀造過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞失水收縮，生長和糖代謝速率變緩。甘油可防止水流出，對酵母具有保護作用，所以在高滲透壓環(huán)境下，酵母激活高滲甘油（high osmolarity glycerol，HOG）途徑，高產(chǎn)甘油[6]。而酵母為維持體內(nèi)的氧化還原平衡，會合成更多的揮發(fā)酸[7]，降低冰酒的香氣，對酒的質(zhì)量存在負面影響[8]。有研究表明，菌株、發(fā)酵溫度[9]及培養(yǎng)基[10]等因素都會影響揮發(fā)酸的產(chǎn)量，但酵母菌種對冰酒揮發(fā)酸含量的影響最大[11]。因此，選育低產(chǎn)揮發(fā)酸的釀酒酵母具有重要應(yīng)用推廣價值。CORDENTE A G等[12]獲得一株低產(chǎn)乙酸的YAP1突變菌株；何娟等[13]對冰酒中分離的酵母菌進行基因分型，為篩選本土優(yōu)良冰酒酵母打下基礎(chǔ)。但在冰酒中應(yīng)用的釀酒酵母的選育研究尚鮮有報道。因此，選育低產(chǎn)揮發(fā)酸的釀酒酵母對冰酒的釀造具有重要意義。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)具有突變率高、突變遺傳較穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點[14]，廣泛應(yīng)用于微生物育種[15-16]。因此，本研究以發(fā)酵性能優(yōu)良卻高產(chǎn)揮發(fā)酸的釀酒酵母NX4為原始菌株，采用ARTP誘變技術(shù)選育低產(chǎn)揮發(fā)酸釀酒酵母，并對其遺傳穩(wěn)定性及耐受性進行分析。同時，應(yīng)用該突變菌株釀造冰葡萄酒，對其理化指標、感官品質(zhì)及揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，以期獲得具有推廣價值的優(yōu)良釀酒酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母NX4：從寧夏廣夏三基地赤霞珠自然發(fā)酵過程中分離，保存于西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院；商業(yè)菌株F15：法國LAFFORT公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、果糖、2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）、2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol，2,4-DNP）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，3,5-DNS）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；K-GCROLGK甘油檢測試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加瓊脂2%。

2-DG培養(yǎng)基[17]：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖8%，2-DG 0.015%，瓊脂2%。

2,4-DNP培養(yǎng)基[18]：葡萄糖2%，無氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）0.67%，2,4-DNP 0.002 2%，瓊脂2%。

TTC培養(yǎng)基[19]下層：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%；上層：TTC 0.05%，葡萄糖0.5%，瓊脂1.5%，115 ℃滅菌30 min。

冰酒模擬汁[1]：葡萄糖200 g/L，果糖200 g/L，L-蘋果酸4.5 g/L，檸檬酸0.3 g/L，酒石酸4.5 g/L，硫酸銨2 g/L，YNB（不含硫酸銨）1.7 g/L，Tween 80 1 mL/L，油酸5 mg/L，pH值3.2，0.22 μm濾膜過濾除菌。

威代爾冰葡萄汁：總糖含量350.2 g/L，總酸（以酒石酸計）含量15.7 g/L，pH值2.9。添加250 mg/L（NH4）2SO4補充氮源，同時加250 μL/L二氨基二環(huán)己基甲烷滅菌，靜置過夜。

1.2 儀器與設(shè)備

MANDELA ARTP誘變儀：北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司；LC-10ATVP液相色譜儀：日本島津公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 常溫室壓等離子體誘變

將菌株NX4接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h。用無菌生理鹽水將培養(yǎng)至對數(shù)期的釀酒酵母NX4制備成菌懸液（1×107CFU/mL），分別在ARTP儀下誘變處理0、5 s、15 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s后，稀釋涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d。對平板進行菌落計數(shù)，以未處理為對照計算致死率，獲得致死曲線，進而確定最佳誘變處理時間。

1.3.2 低產(chǎn)揮發(fā)酸突變菌株的篩選

平板初篩：誘變后的菌懸液稀釋涂布于2-DG、2,4-DNP和TTC培養(yǎng)基平板，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，挑取2-DG、2,4-DNP培養(yǎng)基平板上的大菌落和TTC培養(yǎng)基平板上的白色菌落，保存。

冰酒模擬汁發(fā)酵復篩：將初篩獲得的突變菌株接種于10 mL冰酒模擬汁中，接種量5×105CFU/mL，于20 ℃、100 r/mim條件下培養(yǎng)10 d，采用高效液相離子排阻色譜法測定乙酸含量。將初篩獲得的突變菌株接種于300 mL冰酒模擬汁中，20 ℃條件下發(fā)酵，當酒精度達到9%vol～14%vol時，測定發(fā)酵液的基本理化指標（揮發(fā)酸含量、殘?zhí)橇?、總酸含量、酒精度）?/p>

1.3.3 遺傳穩(wěn)定性的測定

將最終篩選得到的突變菌株進行傳代培養(yǎng)，取5代和10代菌體接種于冰酒模擬汁中，20 ℃條件下發(fā)酵20 d，測定揮發(fā)酸含量。

1.3.4 耐受性的測定

將最終篩選得到的突變菌株分別接種于含不同酒精度（12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、SO2（400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L）、葡萄糖（300 g/L、400 g/L、500 g/L）的YEPD培養(yǎng)基，接種量為5×106CFU/mL，25 ℃靜置培養(yǎng)，每隔4 h觀察產(chǎn)氣，發(fā)酵3 d后測定OD600nm值，考察突變菌株的酒精、SO2及糖耐受性。將最終篩選得到的突變菌株接種于YEPD培養(yǎng)基，接種量為5×106CFU/mL，于20 ℃、14 ℃、8 ℃和4 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)，每隔4 h觀察產(chǎn)氣，發(fā)酵3 d后測定OD600nm值，考察菌株的低溫耐受性。

1.3.5 威代爾冰葡萄汁發(fā)酵

將復篩獲得的突變菌株、原始菌株NX4及商業(yè)菌株F5分別接種于800 mL威代爾冰葡萄汁中，接種量5×105CFU/mL，18 ℃靜置發(fā)酵。當酒精度達到9%vol～14%vol時，添加SO2至終質(zhì)量濃度為50 mg/L，4 ℃終止發(fā)酵，測定冰葡萄酒的基本理化指標。4 ℃陳釀6個月后測定揮發(fā)性風味物質(zhì)，并對其進行感官評價。

1.3.6 測定方法

乙酸含量[20]：采用高效液相離子排阻色譜法進行測定。殘?zhí)恰⒖偹岷蛽]發(fā)酸含量：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定，總酸以酒石酸計，揮發(fā)酸以醋酸計。酒精度：采用生物傳感分析儀測定。甘油：參照文獻[21]的方法測定。

感官評分：選取15名經(jīng)過培訓的品嘗員，參照GB15037—2006《葡萄酒》從外觀、香氣、口感、品質(zhì)4方面對冰葡萄酒進行感官評分，滿分100分。

揮發(fā)性物質(zhì)：采用攪拌棒萃取法提取發(fā)酵液中的香氣物質(zhì)，采用GC-MS方法測定，具體方法參照文獻[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫室壓等離子體誘變時間的確定

釀酒酵母NX4經(jīng)ARTP誘變處理后的致死曲線見圖1。由圖1可知，當誘變時間為65 s時，致死率為92.73%，在85%～95%之間，因此，確定最佳誘變處理時間為65 s。

圖1 常溫室壓等離子體誘變后釀酒酵母NX4的致死率曲線Fig.1 Lethal rate curve of Saccharomyces cerevisiae NX4 induced by atmospheric and room temperature plasma

2.2 低產(chǎn)揮發(fā)酸釀酒酵母的篩選

誘變后的釀酒酵母NX4在2-DG培養(yǎng)基、2,4-DNP培養(yǎng)基和TTC培養(yǎng)基的生長情況見圖2，挑選2-DG培養(yǎng)基、2,4-DNP培養(yǎng)基平板上的大菌落和TTC平板上的白色菌落共260株保存。

圖2 常溫室壓等離子體誘變后釀酒酵母NX4在2-DG（a）、2,4-DNP（b）和TTC平板（c）上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Saccharomyces cerevisiae NX4 induced by atmospheric and room temperature plasma on 2-DG (a),2,4-DNP (b) and TTC plate (c)

初篩得到的突變菌株經(jīng)10 mL冰酒模擬汁發(fā)酵后，從中篩選出9株低產(chǎn)乙酸的突變菌株，分別為菌株T2-5、T2-20、T2-30、T2-42、T3-38、T3-47、2DG136、DNP2-72 和T3-10，其乙酸產(chǎn)量見表1。由表1可知，突變菌株的乙酸產(chǎn)量為2.20～2.45 g/L，較原始菌株NX4（2.90 g/L）降低15.52%～25.5%。

9株篩選菌株經(jīng)過300 mL冰酒模擬汁發(fā)酵后，測定發(fā)酵液的基本理化指標，結(jié)果見表2。由表2可知，突變菌株T2-5的揮發(fā)酸產(chǎn)量最低，為2.40 g/L，較原始菌株NX4降低23.1%。與原始菌株NX4相比，其總酸含量降低9.4%，酒精度和殘?zhí)橇繜o顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇突變菌株T2-5為目標菌株進行進一步研究。

表1 低產(chǎn)乙酸突變菌株的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of low-yield acetic acid mutant strains

表2 冰酒模擬汁發(fā)酵樣的基本理化指標Table 2 Basic physical and chemical indexes of ice wine simulation juice fermentation samples

2.3 突變體菌株T2-5的遺傳穩(wěn)定性

突變菌株T2-5經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，選取傳代5次和10次的菌株發(fā)酵冰酒模擬汁，測定揮發(fā)酸含量，結(jié)果見圖3。

圖3 突變菌株T2-5的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strain T2-5

由圖3可知，突變菌株T2-5傳代5次和10次后揮發(fā)酸產(chǎn)量無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，突變菌株T2-5具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 突變體菌株T2-5的耐受性

突變菌株T2-5的酒精、SO2、糖和溫度耐受性測定結(jié)果見表3及圖4。由表3及圖4可知，原始菌株NX4的酒精耐受性顯著高于突變菌株T2-5（P＜0.05），SO2耐受性無明顯差異（P＞0.05）。突變菌株T2-5在糖含量為300 g/L時，菌體量顯著高于原始菌株NX4（P＜0.05）；而在糖含量為400 g/L和500 g/L時，菌體量較原始菌株NX4低，但產(chǎn)氣較快，表明其具有較好的糖耐受性。突變菌株T2-5在低溫耐受性上弱于原始菌株NX4，但差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，突變菌株T2-5具有較低的酒精耐受性，利于冰酒發(fā)酵到適宜酒精度后發(fā)酵終止，其所具有的高糖耐受性，有利于順利啟動冰酒發(fā)酵。

表3 以產(chǎn)氣特征為評價指標突變菌株T2-5的耐受性Table 3 Tolerance of mutant strain T2-5 using gas production characteristic as evaluation index

圖4 以O(shè)D600nm值為評價指標突變菌株T2-5的酒精（A）、二氧化硫（B）、糖濃度（C）和溫度（D）耐受性Fig.4 Alcohol (A),SO2(B),sugar content (C) and temperature (D) tolerance of mutant strain T2-5 using OD600nmvalue as evaluation index

2.5 冰葡萄酒制備

2.5.1 冰葡萄酒的基本理化指標

分別采用突變菌株T2-5、原始菌株NX4及商業(yè)菌株F15發(fā)酵威代爾冰葡萄汁制備冰葡萄酒，測定冰葡萄酒的基本理化指標，結(jié)果見表4。由表4可知，與原始菌株NX4相比，突變菌株T2-5發(fā)酵的冰葡萄酒的揮發(fā)酸含量降低26.4%，其他指標均無顯著差異（P＞0.05）。與商業(yè)菌株F15相比，基本理化指標均無顯著差異（P＞0.05）。

表4 冰葡萄酒的基本理化指標Table 4 Basic physical and chemical indexes of ice wine

2.5.2 冰葡萄酒的感官評價

冰葡萄酒陳釀6個月后，選取15位感官品嘗員對其進行感官評價，結(jié)果見表5。由表5可知，突變菌株T2-5發(fā)酵的冰葡萄酒呈淺金黃色，澄清；香氣濃郁度中等，具有典型的花香、蜂蜜、蜜桃、檸檬、甜瓜等熱帶水果香氣，淡淡的餅干味，香氣持久；口感適中平衡，品質(zhì)好。其感官評分最高，為77.14分，優(yōu)于其他兩個冰葡萄酒樣。

表5 冰葡萄酒的感官評分Table 5 Sensory evaluation score of ice wine

2.5.3 冰葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的測定

冰葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的測定結(jié)果見表6。由表6可知，從3種冰葡萄酒共檢出29種揮發(fā)性物質(zhì)，包括高級醇類、酯類、酸類、萜烯類和醛酮類等物質(zhì)。

與菌株F15釀造冰葡萄酒相比，菌株T2-5釀造冰葡萄酒檢出的香氣種類較多。菌株T2-5釀造冰葡萄酒具有更多的乙酸己酯、棕櫚酸乙酯、辛酸、壬酸、肉豆蔻酸等酸類以及萜烯類和醛酮類香氣物質(zhì)。

與菌株NX4釀造冰葡萄酒相比，菌株T2-5釀造冰葡萄酒的甜果類香氣略高，高級醇類、酯類香氣物質(zhì)的含量略低，但差異不大，主要包括異戊醇、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、己酸乙酯、庚酸乙酯等香氣物質(zhì)，使得菌株T2-5釀造冰葡萄酒在菠蘿、香蕉、玫瑰花等香氣上濃郁度略降低，這與感官品嘗結(jié)果一致。在酸類香氣上，菌株T2-5釀造冰葡萄酒明顯低于菌株NX4釀造，主要包括辛酸、壬酸、癸酸、9-癸烯酸等香氣物質(zhì)。菌株T2-5釀造冰酒具有更為優(yōu)雅的淡淡的奶油香氣，出現(xiàn)酸敗、粗糙不適的香氣缺陷風險很小。同時菌株T2-5釀造冰酒具有更高濃度的1-辛烯-3-醇、苯乙醇、玫瑰醚、十一醛等香氣物質(zhì)，彌補玫瑰類、具有更濃郁的薰衣草等清甜類的花香。

表6 冰葡萄酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定結(jié)果Table 6 Determination results of volatile flavor compounds in ice wine

續(xù)表

3 結(jié)論

釀酒酵母NX4經(jīng)ARTP誘變后，利用平板初篩、冰酒模擬汁發(fā)酵復篩獲得一株低產(chǎn)揮發(fā)酸的突變菌株T2-5，其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，更高的糖耐受性和更低的酒精耐受性，利于在冰酒中應(yīng)用。與原始菌株NX4相比，利用該突變菌株釀造的冰酒揮發(fā)酸含量降低26.4%，感官評分較高（77.14分），香氣濃郁度有所降低，但持久性增強，具有典型的花香、蜂蜜、蜜桃、檸檬、甜瓜等果香，口感更豐富圓潤，品質(zhì)有所提高。其中高級醇類、酯類物質(zhì)濃度略低，酸類明顯降低，同時，具有更高濃度的1-辛烯-3-醇、苯乙醇、玫瑰醚、十一醛等香氣物質(zhì)。