康 娟，鄧艷春

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(pseudohypertrophy muscular dystrophy)是最常見的遺傳性肌肉疾病，包括杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy，DMD)和貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(becker muscular dystrophy，BMD)，二者均是由編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin，也稱DMD基因)基因突變所致的X-連鎖隱性遺傳病[1，2]。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者由于抗肌萎縮蛋白缺乏導(dǎo)致了骨骼肌細(xì)胞膜缺陷，細(xì)胞內(nèi)的肌酸激酶等外漏，肌細(xì)胞壞死、脂肪組織和纖維結(jié)締組織增生[3]。臨床表現(xiàn)為骨骼肌的進(jìn)行性萎縮、無力、腓腸肌假性肥大。其中DMD的發(fā)病率約占活產(chǎn)男嬰的1/3500[2]。此型患者通常于4～5歲表現(xiàn)出雙下肢運(yùn)動(dòng)乏力，呈進(jìn)行性加重，8～12歲喪失行走能力，20歲左右死于呼吸衰竭或心力衰竭；BMD發(fā)病率約為1/12000[4]，癥狀較輕，部分患者從16歲喪失行走能力，少數(shù)到50歲、60歲才出現(xiàn)臨床癥狀，病情嚴(yán)重程度不等[5]。目前國(guó)際上關(guān)于DMD/BMD的基因治療取得突破性進(jìn)展，如通過輸注反義寡核苷酸誘導(dǎo)外顯子跳躍而糾正讀框移位，或在翻譯過程中抑制無義突變等方法[6～9]，盡早明確臨床DMD/BMD診斷，為及時(shí)進(jìn)行基因治療及綜合治療提供條件。目前臨床基因檢測(cè)方法較多，合理選擇檢測(cè)方法，利于高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確為臨床提供驗(yàn)證，DMD/BMD的基因診斷多采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) (multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，快速分析患者DMD/BMD基因缺失突變/重復(fù)突變，外顯組測(cè)序 (Exome sequencing) 補(bǔ)充點(diǎn)突變及拷貝數(shù)檢測(cè)，Sanger測(cè)序可用于點(diǎn)突變驗(yàn)證[10～12]。本研究，我們合理選擇上述方法，對(duì)10例 DMD/BMD患者進(jìn)行了基因突變分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 我們通過收集2016～2019年我科10例臨床診斷DMD/BMD患者的臨床資料，知情同意后，選擇性應(yīng)用MLPA、外顯組測(cè)序及Sanger測(cè)序技術(shù)，從基因水平驗(yàn)證臨床診斷。臨床納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床表現(xiàn)有進(jìn)行性肌無力，以肢體近端為著，腓腸肌肥大，查體有Gower征陽(yáng)性；(2)心肌酶譜化驗(yàn)：肌酸激酶升高，正常值的數(shù)十倍及以上，并排除心臟和肝臟疾病；(3)肌電圖或肌肉活檢提示肌源性損害。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 在知情同意的前提下，采集患者外周靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中。使用BloodGen Midi Kit (CWBIO，中國(guó)) 試劑盒按照說明書進(jìn)行提取患者全基因組DNA。

1.2.2 MLPA分析 SALSA MLPA探針組 P034-B2/P035-B1 DMD試劑盒購(gòu)自荷蘭MRC-Holland公司 。用 TE溶液稀釋DNA樣本至 40 ng/μl，取 5 μl DNA樣本，依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行DNA變性、雜交、連接、PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3130中進(jìn)行毛細(xì)管電泳；應(yīng)用 Genemapper4.0軟件和 Coffalyser軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 外顯組測(cè)序 將先證者全血使用全基因組DNA提取盒(天根DP349，北京)按照產(chǎn)品說明提取基因組DNA，取1 μg DNA 經(jīng)Cavoris儀(美 國(guó) Covaris公 司 )將其打斷至200 bp左右，DNA片段在Klenow Fragment、T4 聚合酶和T4多核苷酸激酶的作用下末端補(bǔ)平修復(fù)，其3’端加上A，連接接頭，形成標(biāo)準(zhǔn)的Solexa測(cè)序文庫(kù)，文庫(kù)擴(kuò)增，與探針雜交，使用鏈霉素磁珠與雜交樣本孵育后洗脫，洗脫產(chǎn)物擴(kuò)增，經(jīng)Illumina Hiseq2500平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 經(jīng)Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，利用BWA(Burrows wheeler aligner)將讀序與人類基因組參考序列(UCSC，Hg19)比對(duì)，再分別使用經(jīng)分析軟件 samtools和pindel進(jìn)行SNP和Indel的過濾篩選，獲得高質(zhì)量可靠的突變。

1.2.5 Sanger法驗(yàn)證 按照常規(guī)的Sanger法對(duì)例9 和例10患者的2個(gè)點(diǎn)突變進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。擴(kuò)增引物如下，例9樣本擴(kuò)增引物為：DD18003793_NNmDeF：TGAGTAGCATATTCCCGTGTCCA，R：CAGAGAACACTCCCCATATCCC；片段長(zhǎng)度778bp；例10樣本擴(kuò)增引物基因DMD-Ex6-seq-F：AATCAGAATAGACTCCTAGCCTT，DMD-Ex6-seq-R：ACTATAACCACTTTCACGCTCC。片段長(zhǎng)度599 bp。二者退火溫度均為60度。

2 結(jié) 果

2.1 MLPA分析結(jié)果 應(yīng)用 MLPA 技術(shù)對(duì)10例患者血液進(jìn)行檢測(cè)，其中8例檢測(cè)到外顯子缺失突變，具體如下：例1外顯子46～52缺失，例2外顯子 45～46、49缺失，例3外顯子 45～47缺失，例4外顯子 44～55缺失，例5外顯子45～47缺失，例6外顯子17～44缺失，例7 外顯子17～44缺失，例8外顯子17～44缺失(見表1)，本組中未發(fā)現(xiàn)外顯子重復(fù)突變病例。

2.2 外顯組測(cè)序 應(yīng)用外顯組測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)分析高通量測(cè)序結(jié)果顯示，例9為非編碼區(qū)突變c. 6832-26(IVS49) G>A，例10為點(diǎn)突變c. 116(exon6) G>T(見表2)，例9和10同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在其他基因變異，因與患者臨床表型無相關(guān)性，所以這些基因變異暫不考慮與DMD/BMD的致病性有關(guān)。

2.3 突變驗(yàn)證采用Sanger法 對(duì)例9～10相應(yīng)的突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。Sanger法測(cè)序與外顯組測(cè)序結(jié)果一致 (見圖1) 。

表1 8例BMD/DMD患者基因缺失結(jié)果

表2 2例外顯組及Sanger測(cè)序結(jié)果

圖1

圖2

3 討 論

DMD基因是人體最大的基因之一，位于Xp21.2，全長(zhǎng)2400 kb，含79個(gè)外顯子，78個(gè)內(nèi)含子[6，13]。DMD基因最常見的突變類型為外顯子缺失，約占55%～65%，外顯子重復(fù)突變?yōu)?%～10%，其余為點(diǎn)突變或微缺失、插入及剪切位點(diǎn)突變等。致病點(diǎn)突變一般為無義突變或移碼突變[14]。

在本研究中，10例患者有8例外顯子缺失突變，其中缺失外顯子集中于第 44～55外顯子 (見表1)，該熱點(diǎn)區(qū)域與多個(gè)文獻(xiàn)中報(bào)道一致[10，15]。1988年報(bào)道指出DMD/BMD多為肌肉組織中抗肌萎縮蛋白(dystrophin)嚴(yán)重不足或缺如，而BMD患者則為抗肌萎縮蛋白部分缺乏或分子量異常，因此，BMD較DMD病情較輕[16]。在本研究中，結(jié)合臨床表型，10例患者中有7例診斷DMD，3例診斷BMD。

在MLPA結(jié)果為陰性的2例患者中，我們應(yīng)用外顯組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了2種新發(fā)點(diǎn)突變，其中例9為非編碼區(qū)突變c. 6832-26(IVS49) G>A，其致病性尚不明確，例10為點(diǎn)突變c. 116(exon6) G>T，ACMG等級(jí)為“致病”。該兩點(diǎn)突變尚未見報(bào)道。但其例9，男，24歲，雙下肢無力15 y，蹲下起立困難，尚可獨(dú)立行走，鴨步，Gower陽(yáng)性；例10，男，63歲，雙下肢無力20 y余，近端肢體無力為主，鴨步，其表型符合BMD。此外，例9和10同時(shí)發(fā)現(xiàn)其他基因變異，因與患者臨床表型不符，所以這些基因變異暫不考慮與BMD發(fā)病有關(guān)。

MLPA和Sanger測(cè)序分別被認(rèn)為是檢測(cè)基因外顯子變異和點(diǎn)突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而需要事先確定測(cè)序的靶向位點(diǎn)以及檢測(cè)范圍有限，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。目前，高通量、快速并且已廣泛應(yīng)用于臨床的NGS已能夠用于DMD的點(diǎn)突變檢測(cè)[10，11]。在臨床上，診斷DMD/BMD時(shí)，臨床表現(xiàn)為肢體無力，體征有腓腸肌肥大、Gower征陽(yáng)性，化驗(yàn)肌酶升高，尤其是肌酸激酶高出數(shù)十倍，肌肉活檢可見肌纖維大小不等，可見肌纖維壞死，抗肌萎縮蛋白免疫組化染色在DMD/BMD患者的肌膜表達(dá)完全缺失或部分缺失?；谏鲜銮闆r，我們可以進(jìn)行基因檢測(cè)：首先選擇MLPA對(duì)患者DMD基因進(jìn)行缺失/重復(fù)突變篩查；對(duì)于MLPA檢測(cè)為陰性者，應(yīng)用外顯組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變和微小突變，并Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。以此，規(guī)范DMD/BMD基因診斷流程。為患者提供遺傳咨詢，更為患者日后選擇基因治療做好準(zhǔn)備。