李潔琦，李 萌，閔連秋

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1 phosphate，S1P)在不同器官中生物學(xué)行為和功能主要由其5個(gè)特異性g蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)[1，2]介導(dǎo)產(chǎn)生。基于S1P受體開發(fā)的藥物芬戈莫德(FTY720)就是一種基于在磷酸化后非選擇性的與5個(gè)S1P受體亞型中的4個(gè)綁定后形成的一種藥物[3]。目前該藥物已經(jīng)用于治療多發(fā)性硬化癥[4]。然而，到目前為止S1P的受體亞型在每種疾病類型中的具體作用機(jī)制尚不清楚。S1P1在腦缺血再灌注損傷中的致病作用表明，F(xiàn)TY720在該病中是通過(guò)作為S1P1功能拮抗劑的來(lái)實(shí)現(xiàn)治療作用的[5]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷發(fā)作后S1P3的mRNA水平升高[6]，這說(shuō)明S1P3可能是腦缺血再灌注損傷的另一致病因素，F(xiàn)TY720對(duì)腦缺血再灌注損傷的療效也有可能通過(guò)抑制S1P3來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。然而，目前還沒(méi)有明確S1P3在局灶性腦缺血再灌注損傷中是否參與了腦損傷過(guò)程，以及S1P3的致病或神經(jīng)保護(hù)作用的報(bào)道[8]。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠模型，在小鼠腦缺血再灌注后給予S1P3拮抗劑CAY10444干預(yù)，評(píng)估各組動(dòng)物腦損傷、腦梗死、神經(jīng)功能缺損和神經(jīng)細(xì)胞死亡等情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性成年昆明小鼠(32 g±3 g，6 w)購(gòu)置于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在晝夜照明07：00-19：00(光)、溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(60±10)%環(huán)境條件下飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1 w后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 CAY10444(賽默飛世爾中國(guó))；Brdu、rabbit anti-NF-κB(p65)、rabbit anti-Iba1、Donkey anti-BrdU、Mouse anti β-actin、DAB購(gòu)于北京博奧深生物技術(shù)有限公司；神經(jīng)元蛋白提取試劑及嵌合綠色熒光PCR試劑購(gòu)于上?；瞪锛夹g(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 小鼠用異氟烷進(jìn)行麻醉，3%濃度用來(lái)誘導(dǎo)，以1.5%濃度維持。通過(guò)腹側(cè)頸部切口分離右頸總動(dòng)脈。從頸動(dòng)脈分叉處向頸內(nèi)動(dòng)脈引入一根硅膠包裹的6-0手術(shù)線，結(jié)扎阻斷大腦中動(dòng)脈。大腦中動(dòng)脈閉塞30 min后，解開結(jié)扎的手術(shù)線，使大腦區(qū)域完全恢復(fù)血流處于再灌注狀態(tài)。在手術(shù)期間，采用保溫措施將動(dòng)物的體溫維持在(37.0±0.5)℃。手術(shù)后，將小鼠置于鼠籠子里飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，按期更換墊料，最后處死動(dòng)物取腦標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為以下3組，每組10只：1.模型組(MCAO組)：按照上述方法制備MCAO小鼠模型；2.藥物干預(yù)組(MCAO+CAY組)：制備MCAO模型動(dòng)物，動(dòng)物腦缺血再灌注時(shí)將CAY10444分別以0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.5 mg/kg的濃度給小鼠腹腔注射；3.假手術(shù)組(正常對(duì)照組)：小鼠除不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈結(jié)扎閉塞外，其他手術(shù)操作與模型組相同。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死評(píng)估 采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)量表評(píng)估功能神經(jīng)受損程度，以確定MCAO后的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡和反射障礙等[9]。在神經(jīng)功能評(píng)分后，采用斷頸法處死小鼠，迅速取出大腦，并在的小鼠大腦磨具刀組中切2 mm厚切片。大腦組織切片用含2%TTC的生理鹽水在37 ℃下孵化20 min。拍攝TTC染色的腦切片圖像，使用圖像分析軟件計(jì)算梗死體積。

1.2.3 組織學(xué)觀察與分析 MCAO術(shù)后1 d和3 d取腦組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析。小鼠采用異氟烷進(jìn)行麻醉，通過(guò)心臟灌注冷的PBS和4%多聚甲醛混合液對(duì)腦組織進(jìn)行固定。分離大腦組織，并在含30%蔗糖的灌流固定液中孵育，4 ℃冰箱過(guò)夜。將腦組織切成20 μm厚切片。在MCAO后1 d進(jìn)行TTC組織化學(xué)染色。腦切片依次在梯度乙醇中水化(100%浸泡3 min，70%浸泡1 min，30%浸泡1 min)，去離子水沖洗，0.06% KMnO4氧化。切片在0.1%醋酸溶液中，用0.01%的 TTC染色30 min，去離子水漂洗，在載玻片烘片機(jī)中干燥，二甲苯浸泡透明處理，然后蓋玻片。

1.2.4 Iba1免疫組織化學(xué)染色 在MCAO術(shù)后1 d和3 d行Iba1免疫組化染色。5 μm 厚切片，二甲苯脫蠟，酒精梯度入水，高壓鍋內(nèi)枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)。切片在含1% H2O2的PBS中氧化15 min，含1%胎牛血清(FBS)的0.3% Triton-X100中阻斷1 h，阻斷非特異性蛋白結(jié)合。然后，腦切片與兔抗Iba1抗體(1∶500)，在4℃ 孵育過(guò)夜。次日，切片與HRP標(biāo)記的抗兔Ig-G二抗(1∶200)室溫下孵育1h。DAB顯色，鏡下觀察終止顯色。用下行乙醇梯度濃度脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.5 BrdU / Iba1免疫熒光雙染 在MCAO后2 d和3 d，每隔12 h給予小鼠尾靜脈BrdU(50 mg/kg溶于PBS中)注射。小鼠處死后，取MCAO后大腦組織切片，與Tris溶液在100℃下孵育30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，Triton X-100中封閉1 h。然后與BrdU(1∶200)抗體在4℃孵育過(guò)夜。切片用HRP標(biāo)記的二抗(1∶200)進(jìn)行孵育。DAB顯色。染色的切片再次用PBS沖洗(3×5 min)，再次進(jìn)行阻斷，與抗體Iba1(1∶500)在4℃孵育過(guò)夜。然后用與Cy3(1∶1000)標(biāo)記的二抗孵育，用抗熒光猝滅試劑進(jìn)行封片。

1.2.6 免疫陽(yáng)性細(xì)胞定量分析 從每個(gè)區(qū)域的不同部分拍攝3張照片，使用Adobe Photoshop CS3軟件進(jìn)行圖像分析。并計(jì)算免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。然后，以單位面積(mm2)的免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量進(jìn)行表示。

2 結(jié) 果

2.1 CAY10444對(duì)MCAO小鼠腦損傷和神經(jīng)功能影響 在MCAO 24 h后，MCAO組小鼠在缺血的皮質(zhì)和紋狀體區(qū)出現(xiàn)嚴(yán)重的腦梗死。使用S1P3拮抗劑CAY10444的干預(yù)組小鼠腦梗死體積明顯減少，且呈劑量依賴性(見(jiàn)表1)。給予最低劑量0.1 mg/kg的CAY10444干預(yù)組動(dòng)物表現(xiàn)為無(wú)效，而給予0.2 mg/kg和0.5 mg/kg的CAY10444對(duì)減輕腦梗死有效，0.5 mg/kg組對(duì)減輕腦梗死和神經(jīng)功能損傷療效最佳。通過(guò)mNSS分析發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)組小鼠在運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡障礙等神經(jīng)功能參數(shù)與MCAO組相比有顯著改善(見(jiàn)表1、圖1)。通過(guò)TTC染色分析缺血后24 h神經(jīng)損傷程度，與MCAO組相比CAY10444藥物干預(yù)組減輕了神經(jīng)損傷的程度(見(jiàn)表1、圖1)。

表1 各組動(dòng)物腦梗死和mNSS評(píng)分表

注：MCAO 24 h后測(cè)定不同劑量CAY10444對(duì)梗死體積和神經(jīng)功能的影響；與MCAO組比較**P<0.01，***P<0.001

注：MCAO 24 h后不同劑量CAY10444對(duì)梗死體積和神經(jīng)功能的影響。與MCAO組比較**P<0.01，***P<0.001

圖1 各組動(dòng)物腦梗死組織學(xué)評(píng)估

2.2 CAY10444對(duì)MCAO腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖的影響 MCAO后1 d和3 d通過(guò)Iba1免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)MCAO組小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況增強(qiáng)，表現(xiàn)為缺血半球的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組增多。與MCAO組相比，CAY10444藥物干預(yù)組在上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量

顯著減少，且呈時(shí)間和區(qū)域依賴性，表現(xiàn)為藥物干預(yù)組小鼠大腦缺血周圍和缺血核心區(qū)域活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(見(jiàn)圖2、圖3)。此外，CAY10444藥物干預(yù)組小鼠大腦缺血核心區(qū)阿米巴樣形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，即阿米巴形態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞/分枝樣形態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞比例降低(見(jiàn)圖3)。

A：CAY干擾對(duì)MCAO后1 d小膠質(zhì)細(xì)胞活化的Iba1免疫組織化學(xué)染色。P為缺血周圍區(qū)，C為缺血核區(qū)域。標(biāo)尺=200 μm。B：缺血核心區(qū)和周邊區(qū)Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的定量分析。與假手術(shù)組比***P<0.001。與MCAO組比##P<0.01，###P<0.001

圖2 腦缺血后1 d，CAY10444降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

A：缺血周邊(P)和缺血核心(C)區(qū)域Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞圖。標(biāo)尺=200 μm。B：缺血核心和周邊區(qū)Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、Iba1陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(阿米巴樣/分支樣小膠質(zhì)細(xì)胞)。與假手術(shù)組比較**P<0.01，***P<0.001；與MCAO組比較#P<0.05，###P<0.001

圖3 腦缺血后3 d小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況

在MCAO 3 d 后對(duì)腦內(nèi)BrdU和Iba1進(jìn)行雙重免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)MCAO組大腦缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖明顯，表現(xiàn)為BrdU/Iba1雙免疫陽(yáng)性細(xì)胞較假手術(shù)組增多。與MCAO組相比，CAY10444藥物干預(yù)組BrdU/Iba1雙免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(見(jiàn)圖4)。

A：BrdU/Iba1雙免疫熒光法測(cè)定腦缺血后3 d，邊緣區(qū)BrdU/Iba1免疫雙陽(yáng)性細(xì)胞圖。標(biāo)尺=50 μm。B：BrdU/ Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞定量分析。與假手術(shù)組比較***P<0.001。與MCAO組比較##P<0.01

圖4 CAY10444對(duì)MCAO后3 d的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

在本研究中，我們探討了S1P受體的亞型S1P3在局灶性腦缺血中的致病機(jī)制，尤其是對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)的影響。MCAO后，通過(guò)特異性拮抗劑抑制S1P3活性可減輕腦損傷。S1P3在缺血性腦中的致病作用與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化密切相關(guān)，包括活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、形態(tài)轉(zhuǎn)化為阿米巴樣和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖。

人們通過(guò)FTY720的作用發(fā)現(xiàn)受體介導(dǎo)的S1P信號(hào)通路是腦缺血損傷的一種可行的治療方案，因?yàn)榱姿峄蟮腇TY720是5個(gè)S1P受體亞型中的4個(gè)亞型的非選擇性調(diào)控子，在嚙齒動(dòng)物中具有神經(jīng)保護(hù)作用。盡管FTY720治療缺血性腦損傷取得了一定的成功，但究竟哪個(gè)或哪幾個(gè)S1P受體亞型是FTY720的實(shí)際介導(dǎo)的因子仍不確定。有研究者采用局灶性腦缺血大鼠模證明S1P1是局灶性腦缺血的致病因素[10]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P3可能是介導(dǎo)腦缺血損傷的另一種S1P受體亞型。另外，最近有報(bào)道認(rèn)為FTY720 的磷酸鹽可作為S1P1的功能拮抗劑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]，這啟發(fā)我們猜測(cè)S1P3也可能對(duì)腦缺血損傷起作用。盡管到到目前沒(méi)有直接證據(jù)能證明這個(gè)猜測(cè)，但是一些研究發(fā)現(xiàn)了FTY 720 磷酸鹽可拮抗S1P3信號(hào)通路?？紤]到FTY720磷酸鹽對(duì)S1P1和S1P3的抑制作用以及既往研究結(jié)果，因此，我們猜測(cè)FTY720對(duì)腦缺血損傷的療效可能是通過(guò)抑制S1P1和S1P3活性實(shí)現(xiàn)的。有研究證實(shí)S1P2不是FTY720-磷酸鹽的靶點(diǎn)，但是S1P2可通過(guò)破壞缺血腦中的血管完整性介導(dǎo)腦缺血損傷。因此，目前為止，人們已經(jīng)確定三種S1P受體亞型為腦缺血的致病因素。然而，目前尚不清楚S1P受體亞型對(duì)腦缺血損傷的介導(dǎo)作用是否存在差異，是否還有其他S1P受體亞型如S1P4或S1P5參與了腦缺血損傷機(jī)制[12]。

S1P3在大腦中有明確的致病作用，但它在缺血條件下的作用是具有組織選擇性的。早期的關(guān)于S1P3在非神經(jīng)缺血模型中的作用的研究報(bào)道存在著一些爭(zhēng)議。如在心臟中，S1P2和S1P3的缺失均可加重小鼠心肌梗死，支持S1P3的心臟保護(hù)作用[13]。然而，在腎臟中S1P3又與缺血后的組織損傷有關(guān)[14]。骨髓組織S1P3的缺失可減輕腎缺血/再灌注后的組織損傷，其表達(dá)缺失可降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，增加抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平[15]。S1P受體的這些不同作用在S1P1中也存在。S1P1受體激動(dòng)劑或內(nèi)皮細(xì)胞S1P1缺失可減少或加重缺血后的腎損傷[16]。然而，在大腦中，S1P1的下調(diào)減輕了腦缺血后的腦損傷[17]。無(wú)論受體介導(dǎo)的S1P信號(hào)在非神經(jīng)組織中的作用如何，S1P1、S1P2和S1P3均參與了腦缺血后的腦損傷發(fā)病過(guò)程。

在本研究中，由于CAY10444是廣泛應(yīng)用的S1P3特異性拮抗劑，因此我們使用CAY10444作為S1P3拮抗劑來(lái)研究其在腦缺血中的作用[18]。有報(bào)道證明S1P2是腦缺血再灌注損傷的致病因素之一，因此S1P2不太可能介導(dǎo)CAY10444在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用[19]。最后，腦缺血中CAY10444的療效有可能僅通過(guò)S1P3介導(dǎo)。

S1P3在腦缺血后的神經(jīng)損傷作用似乎與腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)，因?yàn)槟X卒中等幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病都會(huì)發(fā)生類似的致病作用[20]。此前，通過(guò)體外和體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，受體介導(dǎo)的S1P信號(hào)通路參與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[21]。最近發(fā)現(xiàn)S1P3介導(dǎo)的局灶性腦缺血腦損傷主要通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)[22]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P3也與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)：使用S1P3特異性拮抗劑抑制S1P3活性，腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以時(shí)間和區(qū)域依賴的方式減少。此外，抑制S1P3活性降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。腦缺血組織中S1P3除了造成活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加外，還與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。在缺血再灌注后3 d時(shí)，缺血核心區(qū)域活化的小膠質(zhì)細(xì)胞大多呈阿米巴樣，并主要通過(guò)釋放多種促炎介質(zhì)導(dǎo)致缺血腦神經(jīng)元損傷。我們的研究表明，抑制S1P3可顯著降低活化小膠質(zhì)細(xì)胞向阿米巴樣形態(tài)轉(zhuǎn)化。